Lamiae
Mémoire extraction et appréciation des pectines à partir des écorces d’oranges et de dattes, tutoriel & technique extraction des pectines en pdf.
Dosages des oses totaux par la méthode de Dubois (Fournier, 2001)
La concentration moyenne des oses totaux est déterminée par la méthode du phénol sulfurique décrite par Dubois, qui est décrite en annexe et dont les grandes lignes sont comme suit: à 0,5 ml d’une solution d’oses, sont rajoutés respectivement 0,5 ml de phénol à 5% et 3 ml d’acide sulfurique, ce dernier dégage une chaleur intense (110 °C) et donne une couleur jaune brune au mélange. Le milieu est vortexé puis maintenu 5 minutes à 100 °C dans un bain Marie pour plus de reproductibilité. Après 30 minutes de refroidissement à l’obscurité, l’absorbance est mesurée à 485 nm.
Des gammes étalons sont réalisées avec des solutions de galactose et d’acide galacturonique entre 0 – 0,15 mg/ml (voir annexe).
Dosages des acides uroniques par la méthode du métahydroxydiphényl (méthode du MHDP de Blumenkrantz et al. 1973)
En milieu acide, les polysaccharides sont hydrolysés en acides galacturoniques et transformés en dérivés furfuriques, ces dérivés se condensent avec le métahydroxydiphényl, pour former des complexes colorés dont l’absorbance, à 520 nm, est proportionnelle à la quantité des acides uroniques.
Dans un tube à essai, 3 ml d’acide sulfurique concentré sont ajoutés à 0,5 ml d’une solution d’oses. Le mélange est porté à 100 °C au bain Marie pendant 15 min. La réaction est arrêtée en plongeant les tubes dans un bain à glace. 50 µl de réactif MHDP (3 mg MHDP dans 2 ml de NaOH 0,125 N) sont ajoutés, le milieu réactionnel donne une couleur rose stable pendant quelques heures, après agitation au vortex, l’absorbance est alors mesurée à 520 nm.
Une gamme étalon est réalisée avec des solutions d’acide galacturonique entre 0 – 0,15 mg/ml (voir annexe).
Détermination du degré de méthyl – estérification (DM). Dosage du méthanol par la méthode colorimetrique de Klavons et Bennets (1986)
La saponification est une réaction qui permet de libérer le méthanol de la pectine.
Celui-ci est mesuré après oxydation en formaldéhyde et réaction avec le 2-4 pentanedione (acétylacétone) selon la méthode colorimétrique de Klavons et Bennets (1986).
2 mg de pectine sont saponifiés avec agitation une nuit à 4 °C dans 1 ml de NaOH 0,01 N., puis la solution est neutralisée avec 6 µl d’HCl 1N.
100 µl de cette solution sont alors prélevés et additionnés de : 0,5 ml de tampon phosphate de potassium (K2HPO4/KH2PO4) 100mM, pH 7,5 et de 0,5 ml d’alcool oxydase (1U/ml), le tout est mis, 15 min dans un bain marie à 25 °C. 1 ml de la solution pentanedione 0,02 mM, préparée dans un mélange d’acétate d’ammonium 2M / acide acétique 0,05 M, sont rajoutés. L’absorbance du milieu de réaction, de couleur jaune, est mesurée à 412 nm.
(Préparation des solutions voir annexe)
Chromatographie phase gazeuse (composition osidique des polymères)
Méthanolyse et sylilation des polysaccharides : analyse par CPG (Fournier, 2001)
0,5-1 mg de pectine hydrolysée dans le trifloroacetique (TFA) a été additionné de 0,5 ml de méthanol acide (MeOH/HCl) 1N, ce qui permet de rompre les liaisons entre les oses.
Le tube à hydrolyse est fermé hermétiquement est placé entre 16 – 24 h à 80 °C, c’est la méthanolyse.
Le méthanol acide est ensuite évaporé sous un flux d’air comprimé. Cette opération est répétée deux fois afin d’éliminer tout résidus d’acide. Pour accélérer l’évaporation un léger chauffage peut accompagner le flux d’air comprimé.
Pour être séparable en chromatographie phase gazeuse, les oses doivent être transformés en dérivés volatils, par exemple par fixation des radicaux silylés. La silylation est amorcée en ajoutant 200 µl de réactif commercial (HMDS + TMCS + pyridine), les tubes sont placés à 80 °C pendant 20 min (voir annexe).
Un système d’injection automatique couplé à la CPG (GC 3300 Varian) permet de prélever 1 µl d’échantillon. L’échantillon est vaporisé est élué de la colonne sous un flux d’hélium. A la sortie de la colonne, les dérivés des oses issus de la dégradation des polysaccharides, sont mis en évidence par un détecteur à ionisation de flamme et identifiés par leur temps de rétention relatif (par rapport à l’étalon interne). Une gamme étalon d’oses connus (acide galacturonique, rhamnose, galactose, glucose,..) subit le même traitement de méthanolyse et de sélylation que les échantillons et sert pour corriger les surfaces des pics.
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