Vésicules décorées : adhésion et transport

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L’adhérence cellulaire : quelques eléments

Dans un organisme multicellulaire, les cellules sont des entités hautement spécialisées, capables de communication et de reconnaissance [Alberts et al., 2002].
En quelque sorte, elles sont “programmées” afin d’avoir un comportement bien défini. Certaines adhèrent entre elles (entre cellules du mˆeme type) pour former des tissus, et interagissent avec la matrice extra-cellulaire. Un exemple type sont les cellules epithéliales, constitutives des tissus séparant l’intérieur d’un vaisseau sanguin des tissus l’environnant. D’autres se déplacent et sont capables de recon-naitre diﬀérents types cellulaires mais de n’interagir avec eux qu’en réponse `a un signal spécifique : les leucocytes circulant dans le sang sont capables de “s’arrˆeter” sur un lieu d’inflammation ou d’infection, afin de lutter contre. L’adhésion d’une cellule sur un substrat est aussi `a la base de la motilité cellulaire.
Ces phénomènes sont impliqués `a des stades très diﬀérents de l’évolution d’un organisme : développement et diﬀérenciation des embryons, renouvellement et cohésion des tissus (pour former des barrières semi-perméables, comme les parois des vaisseaux sanguins), défense de l’organisme contre des attaques extérieures (comme le font les leucocytes, qui “traquent” dans nos vaisseaux les agents pa-thogènes)… ou bien, et plus malheureusement, cancer (une métastase qui migre d’un organe malade vers un autre s’est en quelque sorte “décollée” de la première tumeur) [Thiery, 2003]. Dans ces fonctions, il y a toujours un phénomène d’adhésion ou de détachement d’une cellule par rapport `a une autre, ou par rapport `a un substrat.
Toutes ces interactions sont médiées par des molécules présentes à la surface des cellules, souvent des protéines ancrées dans la membane cellulaire, et appellées pour cela molécules d’adhésion cellulaire (en anglais Cell Adhesion Molecules ou CAMs). On estime que plus de 3% des protéines codées dans le génome humain font partie par au moins une de leur fonctions connues des molécules adhérentes [Thiery, 2003].
D’une manière très générale, on nomme ces molécules des récepteurs : leur re-connaissance moléculaire est généralement hautement spécifique (via des contraintes géométriques, des liaisons hydrogène,…). C’est ce qui diﬀérencie l’adhésion de type cellulaire, via des assemblages de molécules “clef-serrure”, des agrégations collo¨ıdales, dues aux attractions classiques (électrostatique, van de Waals,…). On per¸coit bien ici le caractère “discret” de l’adhérence induite par ces molécules, qui sont généralement présentes en faibles quantités à la surface des cellules.

Assemblage en tissus : exemple de l’endothélium

Un cas particulier de tissu, l’endothelium vasculaire, qui est celui qui tapisse les parois des vaisseaux sanguins, est un bon exemple pour illustrer ces diﬀérents types de jonctions entre cellules. Les assemblages intercellulaires que forment les molécules d’adhérence (jonctions) en s’associant sont des entités très localisées. Ils sont classifiés en trois groupes, suivant leur structure (en termes de distance entre membranes) et leur fonction (imperméabilisation des assemblages ou com-munication) : les jonctions étanches, les jonctions adhérentes et les jonctions de communication.
Sur la Fig. 1.1 est présentée la zone de contact entre deux cellules de l’en-dothélium ainsi que les diﬀérentes jonctions cellulaires dont on vient de parler.
Ce tissu joue plusieurs rˆoles cruciaux dans notre organisme : il contrˆole la circulation sanguine, permet les échanges de gaz (O2, CO2) entre les organes et le sang, intervient dans les propriétés de coagulation lors d’une blessure. C’est donc une paroi solide mais aussi capable de laisser les globules blancs passer (par extravavasation) pour aller réparer une inflammation ou lutter contre un foyer infectieux. Il n’est pourtant formé que d’une monocouche de cellules endothéliales liées entre elles latéralement et qui sépare l’intérieur du vaisseau (cˆoté luminal, o`u se trouve le fluide sanguin) de la matrice extra-cellulaire (cˆoté basolatéral).
Les jonctions existant entre ces cellules sont responsables de la forte cohésion de l’endothélium : en partant du cˆoté luminal (“extérieur”, Fig. 1.1) et en des-cendant dans le tissu (vers le cˆoté “intérieur”), on trouve successivement (i) les jonctions dites étanches (ou ZO, pour zonula occulens, sur la Fig. 1.1), qui sont formées par des protéines appelées claudines et occlusines, et imperméabilisent le vaisseau ; (ii) les jonctions dites adhérentes (ou ZA, pour zonula adherens, sur la Fig. 1.1), qui sont formées essentiellement par des cadhérines, qui entourent la cellule comme une ceinture et sont reliées `a des filaments d’actine ; (iii) les jonctions dites de communication (ou gap junctions), qui permettent le passage d’ions ou de petites molécules entre deux cellules contig¨ues via des canaux formés d’hexamères de connexines.
Les interactions avec la matrice extracellulaire (fibres de collagène,…) située cˆoté basolatéral sont réalisées via d’autres catégories de protéines d’adhésion, les intégrines. Lors d’une interaction entre un lymphocyte et la paroi endothéliale (cˆoté luminal), ces mˆemes intégrines ainsi que des sélectines, sont impliquées [Alberts et al., 2002].
L’endothélium est un cas particulier d’épithélium simple. Sur la Fig. 1.2 est présentée la zone de jonction entre deux cellules epithéliales vue en microscopie électronique : on peut remarquer l’organisation similaire de celle-ci par rapport `a l’organisation décrite sur la Fig. 1.2. La jonction de type “desmosome” (Ma) n’existe pas entre cellules endothéliales.

Adhésion et perméation de leucocytes

En réponse `a une inflammation, les leucocytes entrainés par la circulation sanguine sont capables d’adhérer, d’abord faiblement, sur la surface d’un vais-seau sanguin se trouvant à proximité de la zone malade (Fig. 1.3). Les cel-lules endothéliales de ce vaisseau y expriment des sélectines, molécules recon-nues spécifiquement par des oligosaccharides présents sur la surface des globules blancs.
Ceux-ci peuvent alors rouler sur la paroi interne du vaisseau jusqu’`a se rappro-cher suﬃsamment de la zone inflammée, au voisinage de laquelle les interactions entre les cellules endothéliales et leucocytes deviennent plus fortes : le système adhésif intégrine (sur le globule) / ICAM (sur la paroi) est activé et immobilise les leucocytes aux zones intercellulaires de l’endothélium. Ainsi, les leucocytes peuvent, en se déformant et en profitant du fait que les cellules de la paroi se font localement un peu plus laches, pénétrer dans les tissus plus profonds (on dit qu’il y a extravavasation) et migrer par chemotaxie vers la zone malade.
On voit que dans ce phénomène, essentiel `a la défense de notre organisme, les processus d’adhésion sont omniprésents et en gouvernent toutes les étapes. La migration qui a lieu après passage ne faillit pas `a cette règle comme nous allons le voir.

Adhésion et motricité cellulaire

Sans adhésion les cellules ne pourraient migrer. En eﬀet, comme le montre la Fig. 1.4, la plupart des cellules progressent par un mécanisme d’adhésion/traction sur des lamellipodes.
Une cellule adhérant sur un substrat par le biais de zones focales d’adhésion doit, pour avancer, à la fois créer de nouveaux points adhésifs, sur lesquels elle va se tracter, et détruire des points adhésifs qui sinon la retiendrait l`a o`u elle se trouve. Ayant “choisi” (en réponse `a des signaux chimiques de type hormones de croissance ou autre) une direction, elle avance un pied en concentrant à l’intérieur de celui-ci de l’actine. Puis ce pied adhère, et la polymérisation de l’actine génère des forces de traction qui vont faire avancer la cellule. Simultanément, celle-ci détruit des points focaux d’adhésion situés en arrière de son mouvement à venir. La cellule bouge, et répète ce cycle de phénomènes jusqu’`a ce qu’elle soit arrivée.
L’adhésion est donc un phénomène dynamique pour la cellule : elle la construit ou la détruit suivant ce qu’elle va faire. L’adhésion est donc `a la fois forte (pour résister `a la traction) et versatile (pour ˆetre faite ou défaite sans coˆuter trop d’énergie `a la cellule). Pour cela, nous avons vu que la cellule utilise beaucoup de molécules, qui chacune adhérerait faiblement avec son complémentaire, et les ordonne en structures qui sont régulées par de nombreuses voies de signalisation.

Les récepteurs moléculaires d’adhérence

Toutes les molécules d’adhérence que l’on vient de citer sont des glycoprotéines présentes à la surface des cellules et présentent trois “segments” (Fig. 1.5) : une partie extracellulaire, jouant le rˆole de récepteur proprement dit (elle sonde le milieu extérieur et va ˆetre le site de la reconnaissance moléculaire et de l’in-teraction avec une cellule voisine) ; une partie transmembranaire hydrophobe, qui va lui permettre de s’intégrer dans la membrane cellulaire ; une “queue” cytoplasmique pouvant lui servir d’ancre au cytosquelette (et la mettant “en contact” avec les voies de signalisation intracellulaire). Elles sont regroupées en cinq grandes familles selon leurs caractéristiques structurales et/ou fonction-nelles : les cadhérines, les immunoglobulines, les sélectines, les intégrines et les protéoglycanes [Gumbiner, 1996]. Elles interagissent avec une molécule de mˆeme type (interaction dite “homotypique”) ou non (interaction dite “hétérotypique”), entre deux cellules qui peuvent ˆetre de mˆeme type (interaction dite “homo-philique”) ou non (interaction dite “hétérophilique”). Les cadhérines sont une famille de CAMs intervenant dans des interactions homotypiques (interactions cadhérine/cadhérine) et homophiliques (entre deux cellules d’endothélium, par exemple).
Il faut noter que le rˆole des CAMs ne se limite pas à ˆetre seulement une “colle moléculaire” : elles interviennent très fortement dans la signalisation cellulaire [Gumbiner, 2000].
Nous allons maintenant nous focaliser sur la famille des cadhérines.

Les cadhérines

Les cadhérines sont des protéines qui, comme nous venons de le voir, sont engagées dans des interactions homophiliques et homotypiques. Ces interactions sont de plus calcium-dépendantes, c’est-à-dire que le calcium est nécessaire à la formation de liaisons entre cadhérines. Dans le corps humain, la concentration en calcium libre est de l’ordre du mM, les cadhérines interagissent pour une concentration locale en calcium entre 1 et 2 mM. Cette concentration locale est régulée par un ensemble de protéines actives présentes dans les membranes. Des études récentes tendent `a montrer qu’un appauvrissement sévère du milieu désorganise les jonctions entre cellules [Rothen-Rutishauser et al., 2002].
La nomenclature des cadhérines couramment utilisée est la suivante : elles portent comme initiale celle du tissu dans lequel on les a identifiées en premier ou dans lequel elles sont majoritaires. Pour exemple, citons la E-cad que nous avons utilisé : elle a et´ identifiée en premier dans l’épithélium. Dans ce tissu, les E-cads se regroupent au niveau des jonctions adhérentes. Ce regroupement, en plus de son lien aux filaments d’actine, est souvent invoqué comme origine de la solidité de la jonction [Shapiro et al., 1995].
Les cadhérines permettent donc la création de tissus solides et diﬀérenciés, par exemple lors de la morphogénèse [Takeichi, 1995]. Il faut noter que toutes les cadhérines ne sont pas purement “homotypiques” : la N -cad (neurale) et la R-cad (rétinale) sont deux exceptions `a la règle et des interactions “croisées” peuvent exister [Shapiro et al., 1995].
De plus, ces protéines ne sont pas qu’une “colle cellulaire”, mais jouent aussi un rˆole de grande importance dans la reconnaissance entre cellules [Takeichi, 1991] et dans la signalisation. Leur expression peut entrainer la diﬀérenciation des cel-lules et la formation de tissus. La dérégulation de cette mˆeme expression est considérée comme étant une étape dans le processus de propagation de tumeurs cancéreuses [Thiery, 2003].
Plusieurs familles de cadhérines existent, `a la fois suivant leur structure (les cadhérines dites classiques ont cinq domaines relativement semblables, les cadhérines atypiques en ont plus), et suivant leur caractère plus ou moins adhérent (les cadhérines de type I sont plus adhérentes que celles dites de type II). Dans ce qui va suivre, nous nous concentrerons essentiellement sur des cadhérines classiques de type I, comme les cadhérines epithéliales.

Les cadhérines dites “classiques”

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à un type de cadhérine, la E-cad. Cette cadhérine fait partie de ce qui est communément nommé les cadhérines classiques. Nous allons présenter ici les aspects généraux de la structure de ces protéines, qui sont des protéines transmembranaires, constituées de trois parties [Gumbiner, 1996, Gumbiner, 2000] (voir Fig. 1.6).
Les cadhérines classiques (comme la E-cad ou la C-cad) présentent à l’extérieur de la cellule leur domaine extracellulaire glycosylé, qui est une espèce de “doigt” formé de cinq segments EC homologues, semblables `a des domaines immunoglo-bulines [Shapiro et al., 1995]. Ces segments ou domaines sont numérotés de 1 `a 5 en partant depuis le domaine le plus extracellulaire (voir Fig. 1.6A). Chaque domaine fait approximativement 4,5 nm de long, pour 3 nm de diamètre. La partie extracellulaire de la protéine, étendue, mesure donc `a peu près 25 nm. Cette partie de la protéine est le site des interactions adhérentes entre cadhérines et donc de la reconnaissance cellulaire. Le calcium, nécessaire `a l’adhérence, est aussi nécessaire au bon repliement de cette partie de la protéine et lui confère une résistance `a la protéolyse : trois ions se fixent entre deux domaines, soit douze pour une cadhérine complète. Cette structure se prolonge par une partie trans-membranaire hydrophobe qui permet `a la protéine de s’ancrer dans la membrane cellulaire.
Enfin, `a l’intérieur de la cellule se trouve une partie cytoplasmique, très conservée entre cadhérines (c’est-`a-dire dont la structure et l’organisation est la mˆeme d’un membre `a l’autre de cette famille), qui est reliée au cytosquelette d’actine par un assemblage d’autres protéines cytoplasmiques (dont les caténines, voir Fig. 1.6B et C). Par le biais de cet assemblage, les cadhérines sont au contact des chaˆınes de signalisation intracellulaire qui consistuent une voie “active” de régulation et de recrutement. Cette fixation joue aussi vraisemblablement un rˆole de renforcement des jonctions entre cellules [Gumbiner, 2000].

Interactions entre cadhérines

De nombreuses études ont porté sur la fa¸con dont ces protéines interagissent et créent une adhésion aussi forte que celle générée dans les jonctions adhérentes des cellules. On peut diviser ces travaux en deux groupes :
1. les expériences in vivo, o`u les biologistes ont utilisé les outils de la biologie moléculaire pour (i) localiser des interactions entre cadhérines et (ii) cerner le rˆole de la partie cytoplasmique et de ses connexions avec les cascades de signalisation ;
2. les expériences in vitro o`u seuls des fragments solubles de la partie extracel-lulaire ont et´ utilisés, afin de comprendre la structure de cette partie et ses implications dans les interactions entre protéines, ainsi que de mesurer les forces mises en jeu lors de l’adhésion.
Nous allons ici tenter de présenter une revue de ces travaux afin de faire état des connaissances et hypothèses sur le mode de fonctionnement des cadhérines. Nous avons choisi de regrouper par thème, plutˆot que par type d’expérience. Il est à noter que les travaux relatés ici portent essentiellement sur des cadhérines classiques que nous avons utilisées.

Role du calcium

Fig. 1.7 – Interactions entre cadhérines de deux cellules adjacentes : inter-actions dites “cis” entre cadhérines de la meme
rôle ? cellule et “trans” entre cadhérines n’appartenant pas `a la mˆeme cellule. Les diﬀérentes questions ouvertes sont signalées : géométrie de la formation du dimère ? Interactions cis/trans ? Zone d’in-terpénétration des parties extracellulaires ? Rˆole du tryptophane 2 ? Rˆole de la partie intracellulaire ?
Le rˆole du calcium en tant que régulateur des interactions adhésives entre cadhérines est maintenant relativement établi. Depuis les travaux de Nagar sur la E-cad [Nagar et al., 1996], le calcium est considér´ comme étant impliqué `a la fois dans la rigification de la structure tertiaire des cadhérines, les rendant plus résistantes `a la protéolyse, et dans la formation des doublets de cadhérines (que nous présentons dans le paragraphe `a suivre).
Depuis que la structure complète de l’ectodomaine de la C-cad a et´ publiée par Boggon et al. [Boggon et al., 2002], on a pu confirmer que le calcium s’inter-cale entre les domaines EC `a raison de 3 ions calcium par site (Fig. 1.6A). Son rˆole direct sur l’adhésion est, lui, encore assez mal compris.

Formation de dimères

Afin d’interagir, les cadhérines de deux cellules voisines doivent former des complexes adhérents. Ce type d’interaction, entre cadhérines de deux cellules diﬀérentes, est appel´ interaction “trans” ou antiparallèle.
Un autre type d’interaction a eté mis en évidence lors de l’étude de frag-ments EC1 (les fragments terminaux de la partie extracellulaire) de la N -cad en cristallographie [Shapiro et al., 1995] : des interactions entre cadhérines “de la mˆeme cellule”, afin de former des dimères ayant une activité adhérente, ont eté observées. Elles portent le nom d’interactions “cis” ou parallèles.
Pour un grand nombre d’auteurs, ces interactions cis sont une condition ini-tiale à la mise en place des interactions adhérentes (pour une revue récente, voir [Leckband, 2002]). Leur origine (et donc la géométrie des doublets qu’elles en-trainent) est encore une question ouverte.
Selon les observations de Shapiro [Shapiro et al., 1995], ces interactions se-raient dues `a un échange de tryptophanes entre deux fragments de cadhérine : un Trp2 du fragment EC1 d’une cadhérine se loge dans une “poche hydrophobe” de la cadhérine voisine et vice et versa. Ce phénomène est indépendent de la présence de calcium, et les EC1 sont “parallèles” (Fig. 1.8A). Selon les observations de Na-gar [Nagar et al., 1996], elles ont lieu au niveau de la zone de fixation des ions cal-ciums, et les EC1 sont “croisés” (Fig. 1.8B). Selon Boggon [Boggon et al., 2002], la géométrie de l’interaction est plus complexe, entre EC1 d’une cadhérine et EC2 d’une autre molécule (Fig. 1.8C).

Table des matières

Vésicules décorées : adhésion et transport
1 Adhésion cellulaire et cadhérines
1.1 L’adhérence cellulaire : quelques éléments
1.1.1 Assemblage en tissus : exemple de l’endothélium
1.1.2 Adhésion et perméation de leucocytes
1.1.3 Adhésion et motricité cellulaire
1.2 Les récepteurs moléculaires d’adhérence
1.3 Les cadhérines
1.3.1 Les cadhérines dites “classiques”
1.3.2 Interactions entre cadhérines
1.4 Les fragments utilisés : EC1 − 2 de E-cad
2 Propriétés des vésicules géantes
2.1 Auto-organisation et propriétés moléculaires
2.1.1 Structure des molécules amphiphiles
2.1.2 Auto-organisation des lipides
2.2 Description mésoscopique d’une bicouche
2.3 Interactions entre bicouches
2.3.1 Interactions non spécifiques
2.3.2 Attractions spécifiques “clef-serrure”
2.3.3 Représentation d’une interaction spécifique
3 Matériel et méthodes
3.1 Les lipides
3.1.1 Provenance et conservation
3.1.2 Une matrice lipidique fluide
3.1.3 Les lipides chélatants
3.1.4 Les lipides “polym`eres”
3.1.5 Décoration avec une “super-glue” moléculaire
3.1.6 Isothermes de compression
3.2 Solutions utilisées
3.3 Méthodes d’obtention de vésicules géantes
3.3.1 Méthode “corse”
3.3.2 Electroformation
3.4 Fabrication de bicouches supportées
3.4.1 Les différentes méthodes
3.4.2 Fabrication par fusion de petites vésicules
3.5 Les microscopies de fluorescence (MF)
3.5.1 Incorporation des colorants dans les membranes
3.5.2 Deux photons et seconde harmonique
3.6 La microscopie interférentielle
3.6.1 Principe et réalisation pratique
3.6.2 Observations
3.6.3 Reconstruction du profil d’une vésicule
3.6.4 Comment jouer sur le contraste des franges
3.6.5 Tension et énergie d’adhésion
4 Mesure de la tension de vésicules lourdes
4.1 Vésicules lourdes posées : détermination de la tension
4.2 Résultats
4.2.1 Sur une population de vésicules
4.2.2 Dégonflement doux d’une vésicule
4.2.3 Mise sous tension photoinduite
5 Adhésion faible : cadhérines
5.1 Préparation de vésicules géantes “décorables”
5.1.1 Décoration par chélation
5.1.2 Variation du % de lipide chélatant
5.1.3 Conclusions
5.2 Adhésion non spécifique due au calcium
5.2.1 Vésicules “nues”
5.2.2 Vésicules “chevelues”
5.2.3 Protection des parois de la cellule d’observation
5.2.4 Conclusions
5.3 Chélation de protéines `a “étiquette 6-His”
5.3.1 Visualisation de la fixation
5.3.2 Effet du % de lipide chélatant
5.3.3 Résistance de la chélation
5.3.4 Conclusions
5.4 Décoration des surfaces de verre avec des protéines
5.4.1 Microscopie de fluorescence
5.4.2 Microscopie `a force atomique
5.5 Adhésion entre vésicules géantes
5.5.1 Réalisation de l’expérience
5.5.2 Résultats des expériences
5.5.3 Conclusions
5.6 Adhésion entre vésicules géantes et surfaces décorées
5.6.1 Réalisation des expériences
5.6.2 Résultats des expériences
5.6.3 Discussion
6 Adhésion forte
6.1 Interactions électrostatiques et “blisters”
6.1.1 Action du pH sur le polycation PAH
6.1.2 Cinétique d’adhésion et instabilité du contact
6.2 Adhésion spécifique forte
6.2.1 Adhésion vésicule/vésicule
6.2.2 Adhésion vésicule/surface décorée
7 Phénom`enes de transport : pores transitoires
7.1 Transport `a travers une membrane
7.1.1 Dans les syst`emes biologiques
7.1.2 Observation de pores lipidiques
7.2 Pores photo-induits : un tensiomètre “de ligne”
7.2.1 Système expérimental
7.2.2 Modèle
7.2.3 Lipides seuls
7.2.4 Tension photo-induite : quel mécanisme ?
7.2.5 Autres méthodes de mise sous tension
7.3 Modification de la tension de ligne
7.3.1 Courbure négative : le cholestérol
7.3.2 Courbure positive : les Tween
7.4 Conclusions et perspectives
Conclusions et perspectives
Bibliographie