Immunohistochimie
Quatre clones différents de PD-L1 ont été testés en immunohistochimie : QR1 (Quartett, Allemagne), 22c3 (PharmDx, Agilent/Dako, Etats Unis), Sp263 (PharmDx, Roche/Ventana, Suisse), E1L3N (Cell Signaling Technology, Pays Bas).
Le protocole d’IHC était le suivant sur la plateforme VENTANA Benchmark Ultra pour 3 clones sur des lames blanches de 4µm d’épaisseur :
QR1 : Dilution au 1/100. Incubation jusqu’à 72°. Révélation de l’épitope par chauffage à 100° dans du tampon Cell Conditioning (CC) 1 pendant 88 minutes. Incubation de l’anticorps pendant 32 minutes. Amplification OptiView (linker + multimère) pendant 16 minutes.
Sp263 : Dilution au 1/50. Même protocole de marquage qu’E1L3N, kit de détection UltraView sans amplification.
E1L3N : Dilution au 1/200, incubation pendant 60 minutes. Révélation de l’épitope par chauffage à 100° dans du tampon CC1 pendant 48 minutes. Incubation de l’anticorps pendant 20 minutes. Amplification avec OptiView (linker + multimère) pendant 16 minutes.
Le 22c3 était fait sur plateforme DAKO Autostainer Link 48 avec le protocole fourni par le fabricant.
Concordance entre les différents clones et Sensibilité/Spécificité du test
Lorsque l’on classait les carottes en fonction du seuil de positivité de 1%, QR1 avait de très bons résultats. Il existait une concordance de 78% avec 22c3, c’est à dire que 22 cas ne se classaient pas dans la même catégorie. La concordance était de 80% avec Sp263 et de 75% avec E1L3N. 22c3 avait une très bonne concordance avec Sp263 (84% des cas se classaient dans la même catégorie). Les concordances avec E1L3N étaient les moins bonnes (77% avec 22c3 et 78% avec Sp263).
QR1 avait une sensibilité de 75% lorsqu’il était comparé au 22c3, de 85% par rapport au Sp263 et de 77% par rapport à E1L3N. La spécificité était de 83% par rapport au 22c3, de 71% par rapport au Sp263 et de 71% par rapport à E1L3N.
En prenant 22c3 comme référence, les sensibilités variaient de 84% (E1L3N) à 95% (Sp263) et les spécificités variaient de 65% (QR1) à 71% (Sp263).
Avec Sp263 comme référence, les sensibilités variaient de 79% (E1L3N) à 85% (QR1) et les spécificités variaient de 71% (QR1) à 91% (22c3).
Enfin avec E1L3N en référence, les sensibilités allaient de 70% (Sp263) à 84% (QR1) et les spécificités allaient de 63% (QR1) à 77% (22c3) .Avec le seuil de positivité de 1%-49%, QR1 montrait de bons résultats. Les résultats comparés à 22c3 étaient concordants dans 79% des cas, dans 78% des cas lorsque comparés au Sp263 et concordants dans 74% des cas quand ils étaient comparés à E1L3N.
22c3 était concordant avec Sp263 dans 81% des cas et dans 77% des cas avec E1L3N. Sp263 et E1L3N étaient concordants dans 81% des cas. QR1 avait une sensibilité variant de 79% (22c3) à 88% (Sp264) tandis que la spécificité variait de 54% (Sp263) à 81% (22c3).
En prenant 22c3 comme référence, les sensibilités variaient de 88% (E1L3N) à 94% (Sp263) et les spécificités allaient de 55% (E1L3N) à 57% (QR1 et Sp263).
Avec Sp263 en référence, les sensibilités variaient de 81% (22c3) à 85% (E1L3N) et les spécificités allaient de 63% (QR1) à 83% (22c3).
Avec E1L3N en référence, les sensibilités allaient de 80% (22c3) à 90% (Sp263) et les spécificités variaient de 52% (QR1) à 69% (22c3) .
Le marquage de PD-L1 par QR1 est très bien corrélé aux autres clones
QR1 était très fortement corrélé aux autres clones de référence 22c3 et Sp263. Comme décrit dans la littérature, les cas les moins bien corrélés dans notre étude sont situés dans les valeurs basses entre 0% et 5% et pas pour les valeurs supérieures à 50%.
Nous avons décidé de travailler avec la valeur la plus élevée de PD-L1 obtenue pour chaque patient à l’image de ce qui se fait en pratique clinique. Lorsqu’un patient bénéficie de plusieurs prélèvements, la décision de traiter reposera sur le prélèvement ayant une expression la plus importante de PD-L1. Ce principe étant lié à la notion d’hétérogénéité tumorale qui explique qu’un premier prélèvement puisse être négatif et le second supérieur à 50% autorisant une immunothérapie potentielle.
D’après la littérature et le contrôle qualité externe européen, les anticorps 22c3 et Sp263 sont les plus utilisés, et sont les mieux corrélés dans notre étude. QR1 montre des résultats proches de ces derniers, ce qui valide sont utilisation éventuelle à leur place.
Score et interprétation du marquage de PD-L1
Chaque carotte du TMA pour chaque anticorps a été lue par un pathologiste expérimenté et les carottes difficilement interprétables ont été relues par un second pathologiste expérimenté pour obtenir une valeur moyenne. Une valeur absolue de l’expression de PD-L1 par les cellules tumorales a été mesurée. Puis les valeurs ont été regroupées en 3 groupes : <1% ;1%-49%; >=50%.
Ces groupes représentent les valeurs seuils pour lesquels une immunothérapie peut être donnée en fonction de la molécule utilisée comme expliqué plus haut.
Seul le marquage membranaire était pris est compte, le marquage uniquement cytoplasmique tout comme l’intensité du marquage n’étaient pas pris en compte. Les cellules immunitaires n’ont pas été incluses dans l’évaluation ainsi que les carottes pour lesquelles il manquait plus de la moitié du tissu ou s’il y avait moins de 100 cellules tumorales.
Corrélation entre les duplicats d’un même patient
Il existait une forte corrélation entre les duplicats pour QR1 avec un coefficient de corrélation de 0,75 (IC95% : 0,64-0,83, p< 0,0001). La distribution des valeurs par rapport à la courbe de référence était peu dispersée avec seulement deux patients très peu corrélés (carotte A = 30% et 40% vs carotte B = 80%). La corrélation était également forte pour le 22c3 avec un coefficient de 0,79 (IC95% : 0,70-0,86) et une distribution très peu dispersée. La corrélation était très forte pour le Sp263 (r=0,80, IC95% : 0,71-0,86) bien que la distribution paraissait plus dispersée que pour les clones précédents. Enfin la corrélation était forte avec E1L3N (r=0,73, IC95% : 0,60- 0,82) avec une distribution dispersée également. Les valeurs de PD-L1 étant corrélées entre elles pour chaque clone, nous avons conservé la carotte avec la valeur la plus élevée parmi chaque duplicat pour la suite des analyses. Cela correspondait à 101 carottes provenant de 101 patients. La répartition était de 66% des cas QR1 négatifs contre 55% pour 22c3, 65% pour Sp263 et 60% pour E1L3N ; 24% des cas QR1 étaient compris entre 1% et 49% contre 34% de 22c3, 21% de Sp23 et 26% d’E1L3N. Enfin 10% des cas QR1 étaient ≥ 50% contre 11% de 22c3, 14% de Sp263 et d’E1L3N. Les différences observées n’étaient pas statistiquement significatives (p = 0,99).
Table des matières
RESUME
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
Tissue Micro Array
Immunohistochimie
Score et interprétation du marquage de PD-L1
Analyses de corrélation entre carottes d’un même patient
Analyses de corrélation entre patients et entre clones
Tests de concordance et Sensibilité/Spécificité
Analyses statistiques
RESULTATS
Caractéristiques générales
Corrélation entre les duplicats d’un même patient
Corrélation des valeurs de PD-L1 entre chaque clone
Concordance entre les différents clones et Sensibilité/Spécificité du test
DISCUSSION
Les duplicats des clones sont bien corrélés
Le marquage de PD-L1 par QR1 est très bien corrélé aux autres clones
Les résultats obtenus avec QR1 sont concordants avec les autres clones
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
Données et figures supplémentaires
