Un test PCR IS6110 en temps réel pour renforcer la lutte contre la Tb

Il permet de compléter le diagnostic règlementaire basé sur l’histologie et la bactériologie. Cependant, les résultats de la PCR ne pouvaient alors être pris en compte dans la décision sanitaire, car ce test ne figurait pas dans les textes réglementaires et l’évaluation de ses performances (analytiques et diagnostiques) n’était que partielle (Figures II.1.3 et II.1.4). Ainsi, l’objectif du travail exposé dans ce chapitre a été d’évaluer la sensibilité et la spécificité analytiques de ce test PCR IS6110 en temps réel. Cependant, cette approche analytique n’étant pas suffisante pour valider l’intégration du test dans les séquences diagnostiques opérationnelles de la Tb, il a fallu impérativement disposer d’éléments de confirmation sur le terrain. En effet, l’évaluation de la sensibilité et la spécificité diagnostiques de cette méthode PCR par comparaison aux techniques officielles de diagnostic de la Tb (histologie et bactériologie) devait permettre de déterminer si l’utilisation de cette méthode en complément des tests officiels pouvait améliorer le diagnostic de la Tb.

Les études de sensibilité et spécificité analytiques sont exposées dans le sous-chapitre 1 et celles de sensibilité et spécificité diagnostiques sont présentées dans le sous-chapitre 2. La spécificité analytique d’un test PCR est sa capacité à distinguer de manière univoque l’agent cible d’autres agents proches génétiquement de la cible d’intérêt et/ou se trouvant dans le domaine d’application. Par conséquent, l’étude de la spécificité analytique du test a également été effectuée afin de vérifier s’il ne permettait pas l’amplification et la détection de bactéries autres que celles présentes dans le MTBC qui présenteraient une séquence analogue ou proche de la cible génétique IS6110.

Pour vérifier la sensibilité analytique du test PCR IS6110, les ADN des espèces bactériennes incluses dans le MTBC, présentant une concentration faible de 100 fg/µl, ont été analysés avec ce test. Cette concentration correspond à 105 copies d’IS6110 pour M. bovis monocopie étudiée (Cf. Annexes XII et XIII), comme le recommande la norme AFNOR NF T 90-471 relative à la détection et la quantification des Legionella et/ou Legionella pneumophila par concentration et amplification génique par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel (AFNOR, 2010)). Nous avons tenu compte de cette norme car elle est à ce jour la seule norme AFNOR diffusée traitant de la technique PCR. En effet, au moment de la rédaction de ce manuscrit, la normalisation (AFNOR) de la technique PCR employée en santé animale Les mycobactéries du MTBC testées ont été les suivantes : M. bovis, M. caprae, M. microti, M. pinnipedii, M. africanum (souches sauvages caractérisées par l’Afssa par PCR RFLP (Annexe IV)) et M. tuberculosis (souche ATCC 27294). M. canetti n’était pas disponible.

Bien que la spécificité du couple amorces et sonde ait été auparavant vérifiée in silico par la société LSI, à partir du logiciel d’alignement de séquences NCBI BLAST, il était cependant nécessaire d’évaluer la spécificité analytique de ce test à partir de l’analyse d’ADN de bactéries (isolées) autres que celles présentes dans le MTBC. En effet, Jordao Junior C.M. et ses collègues ont démontré en 2009 la présence de mycobactéries non tuberculeuses (MNT) (M. simiae, M. kansasii, M. flavescens, M. gordonae) dans le lait cru de buffle d’eau, au Brésil. Ils ont également montré que ces résultats étaient en accord avec des publications antérieures, par exemples de Leite C.Q.F. et al. en 2003 (M. fortuitum, M. marinum, M. kansasii, M. gordonae, identifiées dans des échantillons de lait (pasteurisé ou non) au Brésil), de Konuk M. et al. en 2007 (lait bovin pasteurisé ou non au Brésil), de Jha V.C. et al. en 2007 (M. xenopi, M. fortuitum, M. chelonae, M. gordonae, M. kansasii, isolées de lait cru de buffle au Népal), de Harris N.B. et al. en 2007 (M. fortuitum retrouvée dans du fromage en Californie).

Sachant que la norme AFNOR NF T 90-471 recommande que les essais d’exclusivité soient réalisés sur des extraits d’ADN de façon à obtenir au minimum 10 000 unités génomes (AFNOR, 2010), toutes les mycobactéries disponibles sauf M. xenopi (soit 20 échantillons, Tableau II.2.1) ont donc été testées pour une concentration en ADN de 0,01 ng/µl (soit 0,05 ng/puits) (Annexe XII). M. xenopi a été testée à partir du lysat d’une colonie (non purifiée et donc non quantifiée).