Un agent nosocomial humain et animal

Le cas particulier de l’ilot de résistance AbaR4

L’ilot AbaR4 fût d’abord identifié chez la souche A. baumannii AB0057 appartenant au GC1 et fût classé en tant qu’ilot AbaR (Adams et al., 2008). Néanmoins, une meilleure connaissance des ilots de résistance chez A. baumannii fait qu’aujourd’hui cet ilot AbaR4 n’est plus classé parmi les ilots AbaRs, mais comme un ilot de résistance indépendant ayant son histoire évolutive propre. L’ilot AbaR4 possède plusieurs caractéristiques spécifiques, comme le transposon composant son squelette, le contenu en gène de résistance, la localisation dans le génome et la distribution chez les lignées clonales d’isolats cliniques, qui sont différents des ilots AbaRs.

Structure

Le squelette de l’AbaR4 est constitué du transposon Tn6022, un transposon différent mais néanmoins relativement proche du Tn6019 formant les AbaRs (figure 16). Le Tn6022 est apparenté au Tn6021 de la souche ATCC 17918, lui-même l’un des premiers transposons apparentés au Tn6019 à avoir été identifié (Hamidian and Hall, 2011; Post and Hall, 2009). Comme le Tn6019, le Tn6022 appartient au même groupe de transposons ciblant un site de transposition spécifique et possède donc les mêmes caractéristiques. On retrouve ainsi les cinq gènes associés à la fonction de transposition (tniCABDE) (Hamidian and Hall, 2011), identiques à plus de 96% avec ceux du Tn6019 (figure 16) (Hamidian and Hall, 2018). Cependant, à la différence des ilots de type AbaRs, les ilots AbaR4 ne portent pas de gènes de résistance aux métaux lourds et ne possèdent pas de région de résistance MARR. En effet, le Tn6022 ne possède pas d’opéron de résistance à l’arsenate, qui est alors remplacé par une séquence codante de fonction inconnue, et le gène uspA n’est pas interrompu par les deux copies du Tn6018 entourant la MARR que l’on retrouve dans les AbaRs. Cependant, l’AbaR4 présente une insertion d’un transposon Tn2006 au niveau du gène sup codant la perméase au sulfate dans le Tn6022. Cette insertion d’un Tn2006 dans un Tn6022 est la caractéristique structurale majeure de l’ilot AbaR4 et ce qui le définit actuellement dans la classification des ilots de résistance chez A. baumannii. 72 Le Tn2006 est un transposon pouvant être retrouvé dans différentes localisations, comprenant majoritairement des ilots de résistance ou des plasmides (Nigro and Hall, 2016) et qui fût le premier transposon portant le gène blaOXA-23 de résistance aux carbapénèmes à être identifié (Corvec et al., 2007). La structure particulière du transposon Tn2006 est essentielle à l’expression d’un phénotype de résistance du fait de la présence de l’ISAba1 en amont du gène blaOXA-23 dans le transposon. Bien que le gène blaOXA-23 puisse être retrouvé en association avec des transposons composites autres que le Tn2006, ceux-ci n’ont jamais été décrits comme présents dans un ilot de résistance chez A. baumannii.

Distribution et localisation

L’ilot AbaR4 peut être retrouvé à la fois chez les isolats du groupe GC1 et chez les isolats du groupe GC2, dans lesquels on le trouve principalement inséré dans de plus grandes structures appelés ilots AbGRI (voir chapitre suivant). A la différence des ilots AbaRs également, il peut être localisé dans différents endroits du chromosome, y compris majoritairement dans le locus du gène comM (Hamidian and Hall, 2011; Holt et al., 2016), mais également dans le locus du gène pho, un gène codant une phosphatase putative, et plus rarement dans d’autres localisations (Bi et al., 2019). De façon intéressante, cet ilot AbaR4 a aussi également été retrouvé sur un plasmide conjugatif, témoignant de son caractère mobile (Hamidian et al., 2014a). Il fût également montré que, malgré une représentation encore faible au niveau globale, la présence simultanée d’un ilot de type AbaR dans le gène comM et un ilot AbaR4 dans le gène pho, comme c’est le cas chez la souche A. baumannii AB0057, était fortement répandue en Angleterre (Turton et al., 2011) et posait le problème d’une combinaison des multiples résistances des AbaRs, à la résistance aux carbapénèmes de l’AbaR4. En outre, des ilots AbaR4 ont également pu être retrouvés dans des isolats cliniques d’autres espèces du groupe A. baumannii comme par exemple chez l’espèce A. nosocomialis (Kim et al., 2012). 

Autres ilots de résistance (groupe GC2)

Chez les isolats du groupe GC2 (à l’exception de la souche ACICU), les ilots de résistance sont différents des ilots AbaRs trouvés chez les isolats du groupe GC1 (Post et al., 2010; Šeputienė et al., 2012). Ils sont appelés ilots AbGRI afin de les distinguer des ilots AbaRs. Parmi les ilots AbGRI, on retrouve les ilots AbGRI-1, insérés dans le gène comM, et les ilots AbGRI-2 pouvant être trouvés à la fois dans le gène comM et à différents endroits du chromosome (Nigro and Hall, 2012; Nigro et al., 2013). Ces deux types d’ilots peuvent être présents simultanément dans le chromosome des isolats du groupe GC2 et présentent une structure complexe (figure 16). Le squelette des ilots AbGRI-1 est constitué d’un transposon Tn6172, apparenté au transposon Tn6021 de la souche ATCC 17978 et d’un transposon Tn6022 tel que retrouvé dans certains isolats du lignage 2 du GC1 (Post et al., 2010). Les ilots AbGRI-2 ont une structure extrêmement variable, résultant de l’accrétion de multiples IS et de transposons, et est apparentée à la région de résistance MARR retrouvées dans les ilots AbaRs (Blackwell et al., 2016). Chez certains isolats du GC2, la présence d’un transposon Tn6022 contenant un Tn2006 forme alors un AbaR4 inséré au sein d’une plus grande structure complexe (Saule et al., 2013). La souche ACICU fait figure d’exception, du fait qu’il s’agit d’un isolat du groupe GC2 portant un ilot de type AbaR retrouvé uniquement dans les isolats du groupe GC1 (Iacono et al., 2008). Cet ilot, appelé AbaR2 ne possède qu’un seul Tn6018, probablement du fait d’un événement de délétion provoquant la perte d’un fragment important de l’ilot (Adams et al., 2008). On retrouve également ce type de gènes de résistance dans les ilots de résistance des isolats du groupe GC2. Dans les ilots de résistance AbGRI-1, le transposon Tn6172 contient le gène de résistance aux sulfonamides sul2 et les gènes de résistance à la streptomycine strA et strB et peut, chez certains variants, contenir des gènes de résistance à la tétracycline. Les ilots AbGRI-2 portent généralement le gène de résistance aux β-lactames blaTEM, le gène de résistance aux sulfonamides sul1, et des gènes de résistances aux aminosides (aadA1, aacC1, aphA1b) (Nigro et al., 2013).

Détection des événements de transformation naturelle chez A. baumannii par cytométrie en flux. 

Contexte 

Au début de ce projet de thèse, il n’existait que peu de données expérimentales sur la transformation naturelle chez A. baumannii. Les connaissances se basent alors principalement sur le modèle A. baylyi ADP1, une souche présentant une capacité exceptionnelle à réaliser la transformation naturelle. Cependant, contrairement à A. baumannii, A. baylyi est retrouvée principalement dans les environnements naturels, n’est pas pathogène pour l’Homme et est susceptible à de nombreux antibiotiques. Ainsi, les deux espèces sont à la fois phylogénétiquement éloignées et appartiennent à des niches écologiques très différentes. En 2013, les travaux de C. Harding et G. Wilharm démontrent que la souche A. nosocomialis M2 et d’autres isolats cliniques d’A. baumannii sont compétents pour la transformation naturelle (Harding et al., 2013; Wilharm et al., 2013). Toutefois, leurs méthodes expérimentales sont totalement différentes. De son côté, Harding réalise une première incubation des bactéries avec de l’ADN transformant pendant 2 heures dans un milieu riche liquide. Puis il réalise une seconde incubation, cette fois sur milieu riche solide, pendant 4 heures avant d’étaler les bactéries sur un milieu de sélection. Il obtient alors des fréquences de transformation naturelle comprises entre 10-7 et 10-6 (Harding et al., 2013). En revanche, G. Wilharm et ses collègues utilisent une méthode particulière basée sur l’hypothèse qu’A. baumannii importe de l’ADN exogène lorsqu’elle réalise une forme de mouvement de surface sur un milieu spécifique. Leur réflexion se fonde sur le fait que le T4P est un élément qui contribue à la mobilité des bactéries, et qui est également essentiel à l’importation d’ADN exogène chez de nombreuses espèces transformables (Averhoff and Friedrich, 2003; Claverys and Martin, 2003). Chez N. gonorrhoeae en particulier, le T4P est impliqué dans les deux processus à la fois (Wolfgang et al., 1998). Pour tester cette hypothèse, G. Wilharm et ses collègues utilisent alors un milieu spécifique semi-solide afin de réaliser leurs expériences de transformation naturelle, sur lequel la bactérie développe une mobilité de 76 surface. Cette méthode leur permet alors d’obtenir des fréquences de transformation naturelle comprises entre 10-8 à 10-3 (Wilharm et al., 2013). Il leur est par ailleurs impossible d’obtenir des transformants en utilisant des cellules planctoniques, comme c’est le cas chez A. baylyi ADP1.

Objectifs 

En se fondant sur ces nouvelles découvertes, notre objectif a été de développer des outils d’étude de la transformation naturelle chez A. baumannii, d’en améliorer les conditions expérimentales et enfin d’évaluer la capacité de transformation naturelle chez cette bactérie. La méthode expérimentale classique de détection des événements de transformation naturelle implique l’utilisation d’un gène servant de marqueur de sélection des bactéries ayant réalisé la transformation naturelle (les transformants). Classiquement ce gène est un gène de résistance à un antibiotique et est présent soit dans le chromosome, soit sur un plasmide chez une souche donneuse de laquelle est extrait l’ADN substrat pour la transformation naturelle. La souche receveuse à l’inverse ne doit pas présenter le phénotype de résistance associé au marqueur de sélection. Les transformants, les bactéries receveuses ayant acquis un nouveau phénotype de résistance, vont alors pouvoir être sélectionnés grâce à l’acquisition du marqueur. Cependant l’utilisation de gènes de résistance aux antibiotiques en tant que marqueurs de sélection chez A. baumannii est rendue difficile par le phénotype de MDR et il est donc souvent nécessaire de connaître le profil de résistance et de susceptibilité aux antibiotiques des souches testées. Or ceci est à la fois fastidieux et compliqué lorsque l’on souhaite faire la détection de ces événements de transformation naturelle à grande échelle, par exemple pour des collections contenant plusieurs dizaines, voire des centaines d’isolats. Ainsi, nous avons d’abord développé une méthode alternative de détection des événements de transformation naturelle, sans utiliser de gènes de résistance aux antibiotiques comme marqueur de sélection, afin de pouvoir ensuite l’utiliser pour évaluer la capacité de compétence pour la transformation naturelle d’une collection d’isolats cliniques d’origine vétérinaire.