NISSR
Préparation des produits à tester
Les méthodes classiques de détermination du pouvoir antimicrobien d’un produit se heurtent souvent au problème de l’insolubilité du produit à tester dans le milieu de culture, ce qui se traduit par l’obtention de résultats peu reproductibles [108]. Pour contourner ce problème, ALLEGRINI et ses collaborateurs [108] ont mis au point une méthode utilisant un émulsionnant, le tween, qui a donné des résultats fiables et reproductibles. Cette méthode a été utilisée avec succès pour l’étude de l’action antibactérienne d’HE de plantes endémiques de Madagascar [109].
Dans notre cas, le tween 80 a été remplacé par le DMSO pour la préparation d’une solution à 20g/ L de produit à tester. C’est un solvant qui dissout bien les extraits, et par sa polarité, s’accommode avec le milieu Muller Hinton qui est aussi polaire. La figure 46 est un cliché des solutions des extraits aux solvants de Hypericum japonicum, obtenues par cette dilution, à savoir :
EB Extrait brut à l’éthanol 80° (tube 1)
EHex Extrait à l’hexane (tube 2)
EDCM Extrait au dichlorométhane (tube 3)
EAE Extrait à l’acétate d’éthyle (tube 4)
EBuOH Extrait au butanol (tube 5)
Figure 46: Solutions à 20g/L dans le DMSO d’extraits de Hypericum japonicum
On prépare de même les solutions des HE à tester, à savoir :
HE totale (6)
HE fraction hydrocarbure (7)
HE fraction oxygénée (8)
Isolement et purification des souches microbiennes
Pour faciliter l’opération d’isolement et de purification des germes bactériens utilisés dans les tests, les souches doivent être cultivées puis repiquées sur des milieux appropriés dont la préparation est donnée en annexe 1.
La culture des différentes souches en stock à l’IPM se fait dans un bouillon de culture, le bouillon TCS, à 37°C pendant 24 heures; c’est la revivification des souches. La croissance de chaque souche se traduit par l’obtention de culture trouble. On prélève alors un inoculum qui est ensemencé par stries serrées à la surface d’une gélose nutritive préalablement coulée dans une boîte de Pétri. Seules les cellules isolées sont déposées et donnent naissance en 24 heures à des colonies provenant de la croissance d’un seul individu. La figure 47 décrit le mode opératoire correspondant.
Figure 47 : Technique d’isolement des germes
Préparation de la suspension microbienne
A partir des cultures précédentes, une suspension microbienne dont la turbidité est de 0,5 Macfarland est préparée, correspondant à 108ufc/ml de bactéries ou de levure. Pour cela, une vérification sur un densimètre est nécessaire (figure 48). Des dilutions successives au 1/ 10è dans l’eau physiologique sont ensuite effectuées jusqu’à obtenir un inoculum de 107ufc/ml de germes.
Ensemencement des germes
Habituellement, l’ensemencement procède par une culture en nappe, c’est-à-dire l’inondation de la gélose par la suspension bactérienne. Nous avons préféré adopté la technique de l’écouvillon qui n’est pas nouvelle, mais semble très peu pratiquée, pourtant elle est de réalisation simple et efficace, en facilitant le séchage de la boîte de pétri après l’ensemencement des germes.
Le mode opératoire consiste à tremper un écouvillon stérile et sec dans l’inoculum, à l’essorer avant de faire l’ensemencement en stries sur toute la surface de la boîte de Pétri contenant la gélose à 3 reprises, en faisant tourner la boite de 60° après chaque application, puis à passer l’écouvillon sur le bord de la boite de pétri dans le but de recouvrir totalement la boite de pétri avec une couche mince d’inoculum (figure 49et 50-a).
Figure 49: Les différents mouvements de stries lors de l’écouvillonnage
On laisse sécher l’inoculum pendant environ 3 minutes à la température ambiante, le couvercle de la boite de Pétri étant fermé.
Dépôts des produits à tester et des antibiotiques
Des disques stériles de papier Whatman de 6 mm de diamètre sont déposés dans les boîtes de Pétri ensemencées de germes microbiens. Les disques sont ensuite imbibés, soit d’une solution de 10l de produits à tester (huile essentielles, extraits), soit d’antibiotiques témoins. Les préparations sont ensuite incubées à 37 °C pendant 24 heures.
Les figures 50-a à 50-c illustrent ces différentes étapes de manipulation.
Figure 50-a :
Ensemencement des germes sur les boîtes de Pétri par écouvillonnage
Figure 50-b : Dépôt des disques et produits sur la culture de germes
Figure 50-c : Incubation dans l’étuve à 37°C pendant 24heures
Figure 50 : Clichés des étapes des tests antimicrobiens
RESULTATS ET INTERPRETATION
Après la période d’incubation, la présence ou l’absence de zone d’inhibition autour des disques est constatée. Les diamètres de zones d’inhibition sont mesurés pour une évaluation de la sensibilité des germes.
L’évaluation de l’activité antimicrobienne d’un produit se fait selon le barême présenté dans le tableau 19.
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