Techniques d’enregistrement de signaux neuronaux

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Imagerie calcique

Le dispositif expérimental au centre de cette thèse est un microscope con¸cu pour capturer des images du système nerveux central de larves de poisson-zèbre, et en tirer des signaux d’activité cérébrale renseignant sur les dynamiques neuronales à l’œuvre dans ses réponses à différents types de sti-mulations. Nous allons voir dans quel contexte biologique et technologique il a etépensé, les raisons qui ont conduit à sa mise au point, ainsi que ses avantages et limitations.

Techniques d’enregistrement de signaux neuronaux

La description et la compréhension du cerveau est devenu l’un des enjeux majeurs de la biologie, mais le domaine des neurosciences est encore parmi les plus opaques que la communauté scientifique ait à explorer. En cause, le nombre d’éléments biologiques (neurones, synapses) impliqués dans chaque mécanisme, et la complexité ainsi que la diversité des connections reliant ces eléments entre eux. Pour ces raisons, le réseau formé par les neurones de n’importe quel système nerveux, que ce soit celui d’un ˆetre humain (1010 neurones, 1014 synapses) ou du ver C.Elegans (302 neurones, 7200 synapses) constitue d’abord un défi de taille en termes d’observation [1] [2] avant mˆeme que se posent les questions d’analyse des interactions entre les nombreux objets observés.
Electrophysiologie Depuis Galvani et sa découverte de l’electricitéani-male [3], le fonctionnement du neurone en tant que brique elémentaire du système nerveux a etébien décrit en termes de potentiels membranaires et de signaux électriques. L’outil majeur qui a permis ces avancées a clairement etél’électrophysiologie, dont les premiers résultats remontent à 1957 [4]. Il s’agit d’insérer in vivo une (ou plusieurs) électrode(s) soit au sein de l’une des cellules à enregistrer (patch-clamp), auquel cas les courants internes de la cellule peuvent ˆetre mesurés précisément, soit dans le milieu extracellulaire pour avoir accès aux signaux de plusieurs cellules aux alentours (dans un rayon de 50 µm). Le principal avantage de cette technique d’enregistrement réside dans la haute fréquence d’échantillonage des signaux enregistrés, qui peut ˆetre de plusieurs kHz. En particulier, cette résolution temporelle per-met d’identifier les potentiels d’actions uniques au sein de bouffées d’activité.
L’électrophysiologie souffre cependant de limitations intrinsèquement liées à la nature des outils utilisés pour ces enregistrements : cette méthode est tout d’abord invasive, puisqu’elle passe par l’insertion d’une électrode dont l’influence sur les neurones etudiés ne peut ˆetre connue, mˆeme si son diamètre ne cesse de se réduire au fil des développements technologiques. De plus, mˆeme si la zone etudiée est globalement connue, il est impossible de connaˆıtre exactement les cellules enregistrées par l’électrode, à moins de disséquer l’échantillon après l’enregistrement, et ces neurones sont en général en assez petit nombre.
Cette technique est en constante évolution et voit régulièrement de nou-velles avancées repousser ses limites : à titre d’exemple, on peut citer des matrices d’électrodes-aiguilles très fines permettant d’observer une zone en 3D [5], qui permet d’augmenter drastiquement le nombre de neurones enre-gistrés tout en minimisant le caractère invasif des mesures.
Imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf ) L’IRMf donne accès `a des enregistrements de l’activité cérébrale `a l’échelle d’un cerveau humain dans son ensemble, soit 4 ou 5 ordres de grandeur de plus qu’avec les enregistrements réalisés en électrophysiologie. Son fonction-nement repose sur le couplage neurovasculaire, c’est-`a-dire les variations d’oxygénation du sang `a proximité des zones cérébrales actives. De plus, l’IRMf peut ˆetre couplée avec l’IRM classique afin de relier les zones d’ac-tivité `a des régions identifiées du cerveau. Cette technique d’enregistrement est utilisable sur l’homme et a permis une analyse en termes de zones d’activité cérébrale pour un large panel de tˆaches ou de stimulations. Cependant, le prix à payer pour ces mesures à grande échelle est une résolution spatiale de l’ordre du mm3 au mieux, accompagnée d’une fréquence d’acquisition limitée à 1 image toutes les 2 secondes.
Les deux techniques présentées ci-dessus permettent donc d’obtenir soit des mesures très précises d’une infime partie du système nerveux, soit des enregistrements de zones cérébrales d’une taille très supérieure à celle du neurone. Depuis bientˆot trente ans, une nouvelle méthode d’enregistrement de l’activité cérébrale cherche à concilier les avantages de ces deux procédés de mesure : l’imagerie calcique [6].
Imagerie calcique Le principe de cette technique d’imagerie est le suivi optique de la fluorescence de rapporteurs calciques, molécules fluorescentes dont l’efficacitéquantique ou les longueurs d’ondes d’émission/excitation dépendent de la concentration d’ions Ca2+ à l’intérieur des cellules du système nerveux. Lorsque la dépolarisation de la membrane augmente suffi-samment sous l’effet de potentiels gradués (le potentiel de membrane dépasse alors une valeur seuil qui est souvent autour de -50 mV), les canaux calciques s’ouvrent et laissent entrer des ions calcium dans la cellule, ce qui se traduit par une la fluorescence du rapporteur.
Ces ions calcium, contrairement aux ions N a+ ou K+ qui sont respon-sables de la dépolarisation des neurones et dont la concentration est elevée dans le milieu intra-cellulaire (140 mM pour K+ et 12 mM pour N a+), sont présents à de très faibles concentrations lorsque la cellule est au repos (entre 50 et 100 nM), mais le passage d’un potentiel d’action multiplie celle-ci par un facteur 10 à 100 [7], tandis que la concentration des autres ions varie très peu. Cela justifie le choix des ions Ca2+ comme rapporteurs privilégiés des potentiels d’actions : si la fluorescence est proportionnelle à la concentra-tion d’ions calcium dans le cytoplasme d’un neurone, le nombre de photons collectés lors d’un train de potentiels d’action sera facilement détectable [8] [9].
Deux types de rapporteurs calciques ont etédéveloppés : les rapporteurs synthétiques et les rapporteurs génétiquement encodés (GECI). Les premiers doivent ˆetre injectés dans chaque échantillon par l’utilisateur. Leurs temps de montée et de descente du signal de fluorescence sont courts et nécessitent donc une fréquence d’acquisition elevée (condition que toutes les caméras utilisées ne peuvent pas remplir). Par ailleurs, il est impossible de contrˆoler précisément la diffusion du rapporteur à partir du point d’injection, et la répartition est rarement homogène. Enfin, la durée d’utilisation du rapporteur n’est que de quelques heures, durée au-del`a de laquelle la concentration devient trop réduite pour produire un signal de fluorescence exploitable. Les rapporteurs génétiquement encodés, malgré des temps de montée et de descente plus longs, ce qui n’est pas nécessairement un désavantage au vu des fréquences d’acquisition de la majorité des caméras, ne sont pas affectés par les autres défauts des rapporteurs synthétiques, et sont directement ex-primés par les organismes génétiquement modifiés au sein des populations de neurones choisies (selon le gène sélectionné).

Rapporteur calcique utilisé : GCaMP6f

GCaMP est une famille de rapporteurs calciques composés d’une molécule de cpEGFP, une protéine fluorescente verte modifiée pour qu’elle se replie circulairement sur elle-mˆeme, liée à une molécule de calmoduline (CaM) ainsi qu’`a un peptide synthétique M13 [10]. La cpEGFP est, mˆeme en l’ab-sence d’ions calcium, fluorescente avec une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 515 nm. La calmoduline, quant à elle, est présente naturellement dans le cytoplasme des neurones, pour les-quels elle joue le rˆole de signalisateur lorsque les ions Ca2+ entrent dans la cellule. Pour cela, elle peut capter jusqu’`a 4 ions calcium. La fixation d’ions calcium sur CaM induit un changement de la conformation du peptide M13, qui à son tour change la conformation de la protéine cpEGFP, ce qui accroˆıt son efficacitéquantique, donc sa fluorescence (voir fig. ?? – a).
Plusieurs générations de GCaMP ont vu le jour, ce qui a permis de créer des sondes calciques avec des rapports signal sur bruit ou des temps de montée et de descente différents. Par exemple, selon le type d’imagerie (voir Dispositifs d’observation en imagerie calcique) et la fréquence d’acqui-sition d’images choisie, l’utilisateur de sondes GCaMP6 peut choisir entre 3 types de rapporteurs, chacun ayant des temps de descente différents : pour GCaMP6f (f pour fast) ce temps de descente est inférieur à la seconde, tan-dis que GCaMP6s (s pour slow ) voit son signal de fluorescence décroˆıtre sur près de 3 secondes (cf fig. ?? – b).
Le rapporteur calcique utilisé dans les expériences présentées dans cette thèse est GCaMP6, développ´ par Loren L. Looger [11]. Les caractéristiques du signal de fluorescence d’un rapporteur calcique sont essentiellement l’aug-mentation relative de ce signal (ΔF/F ) lors d’un train de potentiels d’ac-tion, et les temps de montée et de descente de cette augmentation. Pour GCaMP6f, ce temps de montée est de 100 ms et le temps de descente d’en-viron 600 ms. Le ΔF/F provoqué par le passage d’un potentiel d’action est supérieur à 0.25 (voir fig. ?? – a).

Dispositifs d’observation en imagerie calcique

Microscope confocal Le fonctionnement de ce microscope repose sur l’utilisation d’un sténop´ (pinhole en anglais), un trou très étroit ne laissant passer que la lumière issue du point focal (conjugué du point focal objet de l’objectif), mais pas des autres points de l’échantillon illuminé (cf. fig. ?? – a). A chaque instant, seule la lumière issue d’un seul point de l’échantillon est collectée et il est donc nécessaire de déplacer l’ensemble {illumination + sténop´ + branche d’observation} pour accéder à la fluorescence issue du reste de l’échantillon.
Microscope à 2 photons Ce microscope utilise la fluorescence issue de l’absorption de deux photons par les molécules fluorescentes, au lieu d’un seul dans la fluorescence standard à l’œuvre dans les microscope confocaux, par exemple [12]. Ce processus d’excitation non linéaire nécessite une den-sité de photons importante pour exciter la protéine fluorescente utilisée. C’est précisément ce qui permet à la microscopie à 2 photons de se passer de sténop´ (cf. fig. ??) : le flux de photons ne sera assez importante pour provoquer la fluorescence que l`a o`u le faisceau issu de la source est foca-lisé, c’est à dire au point focal de l’objectif. Dans ce dispositif, c’est donc par l’illumination, et non par la collection, que s’opère le sectionnement op-tique. Par ailleurs, les longueurs d’ondes utilisées permettent une meilleure pénétration dans les tissus biologiques [13]. Comme pour l’imagerie confo-cale, l’acquisition d’image se fait toujours point par point, ce qui limite la fréquence d’acquisition à moins de réduire le nombre de pixels composant la zone imagée.
Ainsi, pour le microscope confocal comme pour le microscope à 2 pho-tons, un compromis doit ˆetre trouvé entre la taille de la région observée et la fréquence d’acquisition. Dans le cadre de la neuroimagerie fonctionnelle, cela oblige, pour appréhender ces réseaux étendus, à fixer une fréquence d’acqui-sition qui tˆot ou tard ne suffira plus à mesurer les variations de fluorescence aux échelles temporelles voulues.
En effet, pour le microscope confocal comme en microscopie à deux pho-tons, la fréquence d’acquisition facq est actuellement limitée par le temps d’exposition τexp via la relation : facqN = τ 1 o`u N est le nombre de points observés sur chaque image. τexp doit ˆetre supérieur ou égal à 1µs pour que suffisamment de photons soient capturés, ce qui oblige l’utilisateur à restreindre la zone d’intérˆet pour augmenter la fréquence d’acquisition.
Malgré toutes les évolutions apportées à ces types de microscopes [14] [15] [16], un nouveau dispositif d’imagerie calcique plus à mˆeme de faire face aux enjeux proposés par la neuroimagerie fonctionnelle a vu le jour il y a un peu moins de 10 ans.

Imagerie calcique par nappe laser

Le principe de l’imagerie par nappe laser est l’illumination par un plan de lumière, généralement obtenue en scannant rapidement un faisceau laser peu collimaté (digital light-sheet), arrivant sur le cˆoté de l’échantillon. Ce plan, qui constitue la nappe laser, assure le sectionnement optique nécessaire à l’imagerie calcique. De la sorte, l’illumination et l’observation se font sur un plan et non plus point par point. La fréquence d’acquisition et la taille de la zone observée sont désormais indépendantes l’une de l’autre, et sont seulement tributaire du matériel utilisé. De fait, pour la nappe laser, la relation entre fréquence d’acquisition et temps d’exposition s’écrit : facq = τ 1 et est indépendante du nombre de points observés. Le récent développement de caméras sCMOS à grand champ et grande cadence d’acquisition permet de tirer partide la zone étendue dans laquelle le sectionnement optique est efficace tout en assurant une bonne résolution temporelle. De plus, et c’est ce qui a initialement motivé les premières expériences utilisant la nappe laser dans un contexte biologique, seul le plan de l’échantillon observ´ est illuminé, ce qui réduit le photo-blanchiment et les effets de photo-toxicité au sein de l’échantillon.
Les premières utilisations de la nappe laser pour imager des objets bio-logiques par fluorescence remontent à 2004, lorsque Huisken et al. utilisent ce processus d’illumination pour observer l’ensemble des cellules musculaires (exprimant de la GFP) d’une larve de poisson Medaka [17], puis pour oberver le développement d’un embryon de drosophile en prenant une image toutes les 5 minutes pendant 17 heures. La résolution atteinte est alors de 6 µm, pour un champ de 1.5 × 0.9 mm. Puis, en 2008, Keller et al. appliquent cette technique au suivi du développement embryonnaire de la larve de poisson-zèbre [18] dont le génome a etémodifié afin que ses cellules expriment toutes la protéine GFP. Avec une résolution de 1 µm, et des images d’une taille de 700 µm × 700 µm, il est possible de suivre l’évolution de l’intégralitédes cellules composant l’embryon pendant plus de 24h, en modifiant l’altitude de la nappe afin d’obtenir une image en trois dimensions de l’échantillon. Le niveau de fluorescence ne diminue pas au cours de l’expérience, preuve que cette technique d’imagerie sauvegarde les qualités fluorescentes des sondes mieux que les microscopes confocaux et à 2 photons.
En 2008 toujours, paraˆıt la première étude faisant état d’enregistrements de signaux neuronaux ex-vivo sur un organe excis´ de souris dans lequel était injectéun rapporteur calcique synthétique, Oregon green BAPTA-1 [19]. En effet, du fait de la géométrie du stystème, l’imagerie par nappe laser est diffi-cile à utiliser in vivo chez la majorité des espèces etudiées en neurobiologie : les tissus biologiques étant généralement opaques, trouver un angle d’illumi-nation tout en pouvant observer la lumière émise à 90° s’avère en général très délicat. Un candidat s’est néanmoins imposé, regroupant les conditions re-quises en termes de taille et de morphologie pour devenir le premier vertébr´ dont la totalité du cerveau peut ˆetre etudié en imagerie fonctionnelle à l’aide d’une nappe laser.

L’imagerie calcique chez la larve de poisson-zèbre

La larve de poisson-zèbre s’est imposée depuis deux décennies comme un organisme modèle important pour la recherche en neurosciences. A l’ori-gine, la majorité des études dont elle faisait l’objet portaient davantage sur le développement des vertébrés. En effet, de nombreux organes sont recon-naissables dès 24 heures après fertilisation, et la quasi-totalité de son corps est transparent (exception faite de quelques pigments, voir paragraphe sui-vant), ce qui autorise un suivi de son développement par microscopie. Depuis l’arrivée de sondes calciques efficaces accompagnées de microscopes permet-tant d’enregistrer les variations de fluorescence de ces rapporteurs, la com-munauté scientifique a également choisi d’utiliser la larve de poisson-zèbre pour des expériences d’imagerie fonctionnelle [20] [21] [22][23]. Pour cela, de nombreux mutants ont eté développés afin de créer des lignées d’animaux exprimant des rapporteurs calciques, comme GCaMP, dans certaines popu-lations de neurones. Par exemple, le promoteur HuC (elavl3 ) contrˆole l’ex-pression dans tous les neurones du système nerveux central, et des larves chez lesquelles GCaMP est sous contrˆole de ce promoteur permettent le suivi de l’activité de l’ensemble du cerveau [24]. On note cette espèce HuC :GCaMPN o`u N identifie la génération de protéine GCaMP utilisée.
En particulier, les larves de la lignée nacre [25] présentent l’avantage de ne pas développer de pigments (voir figure ?? – a), à part ceux de la rétine. En croisant cette lignée avec des poissons exprimant des rapporteurs cal-ciques dans les populations de neurones voulues, on obtient des individus totalement transparents, dont les neurones sont fluorescents et dont l’acti-vité peut ˆetre suivie par les méthodes optiques présentées précédemment. C’est ce type de mutant, couplé avec HuC :GCaMP qui sera utilisé dans toute la suite de notre travail (voir figure ?? – b).
En 2013, M.Ahrens et al. [26] et l’équipe Imagerie calcique et comportement du poisson zèbre du Laboratoire Jean Perrin [27] publient simul-tanément les premières images et les premières mesures tirant parti de la technique d’imagerie par nappe laser et de l’utilisation de larves de poisson-zèbre issues des lignées nacre et HuC :GCaMP (Schéma en figure 3.1). C’est la première fois que la totalité du cerveau d’un vertébr´ est observée en imagerie fonctionnelle avec une résolution suffisante pour accéder à l’activité des neurones individuellement (voir figure 2.1). Si le rˆole de ces premières publications est surtout de décrire une nouvelle méthode d’imagerie et ses caractéristiques, d’autres études menées depuis ont montré que l’utilisation de la nappe laser permettait, en repoussant les limites rencontrées jusqu’ici en termes de résolution temporelle et de fenˆetre d’observation, de franchir un palier dans la compréhension du système nerveux de la larve de poisson-zèbre [28] [29].

Perspectives

Depuis les premiers résultats obtenus à l’aide de la nappe laser, plu-sieurs équipes ont développ´ des améliorations de ce système d’observation, comme par exemple le light-sheet confocal dans lequel le faisceau scanné est conjugué avec la zone d’ouverture de la caméra à chaque instant, aug-mentant ainsi la résolution axiale [31]. Par ailleurs, les améliorations du matériel à disposition (les caméras de plus en plus sensibles et rapides, no-tamment) laissent présager de nombreuses avancées dans la qualité et la quantité d’images enregistrées.
L’un des progrès les plus importants est à mettre à l’actif de S.Wolf et al. [32], qui ont adapté le principe de la microscopie à deux photons présentée ci-dessus au montage à nappe laser (prolongeant le travail de Truong et al. qui avaient déj`a utilisé ce principe pour une description physiologique d’em-bryons de drosophile et de poisson-zèbre [33]), en excitant la fluorescence de GCaMP6f au moyen d’un laser infrarouge pulsé. En effet, la source de lumière servant à l’illumination de l’échantillon en régime monophotonique ayant une longueur d’onde de 488 nm, la larve de poisson-zèbre est, dans ce régime d’excitation mono-photonique, sans cesse stimulée visuellement par la nappe elle-mˆeme. Cette illumination intense dans le bleu représente un fond lumineux qui peut jouer un rˆole sur la perception qu’ont les larves des stimulations visuelles qu’on leur présente, que ce soient des flashs ou des motifs défilants. Ainsi, ce montage de nappe laser avec illumination à deux photons permet de plonger les individus etudiés dans le noir (les larves de poisson-zèbre ne voient pas l’infrarouge [34]) pendant l’enregistrement des données, et d’analyser leurs réponses à des stimulations visuelles sans au-cune perturbation par l’illumination.
Les perspectives offertes à la fois par les progrès technologiques et ce nouveau procéd´ d’illumination en infrarouge sont encourageantes à plu-sieurs points de vue : d’une part, les mesures seront de plus en plus précises, résolues en temps et permettront une compréhension toujours plus fine du système nerveux d’un organisme modèle pour les neurosciences. Pa-rallèlement à cette évolution en termes de performances, le fait que l’illumi-nation ne stimule plus le système visuel de la larve permet d’envisager de nombreuses expériences o`u d’autres modalités sensorielles seraient stimulées simultanément à la vision. Ainsi, on pourrait non seulement décrire avec une précision de l’ordre du neurone unique le fonctionnement de centres senso-riels (comme cela a etéfait par électrophysiologie pour la rétine du chat, par exemple), mais également les interactions entre plusieurs de ces centres et les plus hauts niveaux d’intégration recevant des signaux d’autres mo-dalités impliquées dans des prises de décision. Toutes ces zones cérébrales, des projections du premier ordre provenant des yeux ou de tout autre or-gane sensoriel aux centres d’intégration de plus haut niveau, peuvent ˆetre distantes de plusieurs centaines de microns, leur activité ne pouvait donc ˆetre enregistrée simultanément à l’aide des microscopes utilisés jusqu’ici. L’imagerie fonctionnelle par nappe laser permettra donc pour la première fois d’établir des corrélations entre les signaux enregistrés au sein de ces différentes aires cérébrales malgré leur éloignement.

Table des matières

1 Introduction 
2 Ligne latérale 
2.1 Imagerie calcique
2.1.1 Techniques d’enregistrement de signaux neuronaux
2.1.2 Rapporteur calcique utilisé : GCaMP6f
2.1.3 Dispositifs d’observation en imagerie calcique
2.1.4 L’imagerie calcique chez la larve de poisson-zèbre
2.1.5 Perspectives
2.2 Expérience comportementale multimodale
2.2.1 Etat de l’art
2.2.2 Origine du dispositif et description du système
2.3 Article
2.4 Stimulations sous nappe laser
2.4.1 Microfabrication et dispositif de stimulation
2.4.2 Nécessité de libérer la queue des larves
3 Détection d’ondes acoustiques 
3.1 Introduction et état de l’art
3.1.1 Description et fonctionnement de l’oreille interne des poissons
3.1.2 Réseaux neuronaux de la voie auditive
3.1.3 L’audition chez la larve de poisson-zèbre
3.2 Présentation du système
3.2.1 Système d’observation
3.2.2 Système de stimulation
3.2.3 Description des protocoles
3.3 Présentation des méthodes d’analyse
3.3.1 Des images brutes `a un signal de fluorescence
3.3.2 Traitement du signal : extraction du signal de fluorescence et inférence de spikes
3.3.3 Détection des artefacts liés au mouvement
3.4 Résultats expérimentaux
3.4.1 Morphologie
3.4.2 Expériences de type 1 : Courbes de réponse
3.4.3 Expériences de type 2 : Regroupement de neurones selon leur variabilité de réponse
4 Conclusion 

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