TECHNIQUES DE BASE DE MARQUAGE MOLECULAIRE

TECHNIQUES DE BASE DE MARQUAGE
MOLECULAIRE

Les marqueurs génétiques

Un marqueur génétique est défini comme un caractère mesurable capable de détecter une variation dans la séquence soit protéique, soit nucléique ou une différence identifiant des caractéristiques phénotypique ou génotypique héréditaires d’un individu (Ndir, 2008). L’utilisation des marqueurs génétiques a connu des évolutions importantes. Au cours de ces dernières années de nouveaux types de marqueurs génétiques appelés marqueurs d’ADN ont ouvert de nouvelles perspectives pour le sélectionneur. Ils constituent des outils essentiels pour l’amélioration des résistances aux maladies et aux insectes Bouchra et al, (2003).

Les marqueurs morphologiques

Ce sont les premiers marqueurs à être utiliser pour l’identification des génotypes. Ils sont basés sur les caractères morphologiques comme la taille, la forme du fruit et de la feuille (Bouchaib et al, 1994).Condit, (1955) cité par Bouchaib et al, (1994) a pu classer un peu plus de 600 variétés de figuier en utilisant ces marqueurs. Cependant, ils sont peu nombreux pour saturer une carte génétique et sont influencés par les conditions du milieu (Adam et Dron, 1993). 

Les marqueurs biochimiques

Les marqueurs biochimiques ou marqueurs iso-enzymatiques correspondent aux différentes formes d’une même enzyme, ils permettent de déterminer la présence de l’allèle correspondant à chacune de ces formes. Ils révèlent un polymorphisme entre individus pour les séquences codantes du génome (Bouchaib et al, 1994). Ces marqueurs biochimiques ont servi dans des études d’identification des variétés. Ils ont révélé chez les espèces cultivées de niébé un niveau de polymorphisme variant entre 4 et 42% (Pasquet, 2000). Cependant ils sont en nombre limité et ne permettent pas d’avoir un polymorphisme suffisant pour caractériser un grand nombre de variétés (De Vienne et al, 1998).

Les marqueurs d’ADN

Les marqueurs d’ADN sont de plus en plus utilisés par les sélectionneurs et constituent des outils dans la caractérisation et l’amélioration des plantes. Ils permettent de caractériser un génome de manière fiable, spécifique et rapide. Ils servent à décrire la variabilité génétique et 5 sa répartition au sein des populations et d’espèces (Santoni et al ,2000). En effet, ils ont permis de construire des cartes génétiques, d’établir des associations entre marqueurs et gènes et de localiser dans le génome les régions qui sont impliquées dans le déterminisme des caractères quantitatifs(QTL)(Santoni et al,2000)

Les marqueurs spécifiques de locus et codominants

Ce sont des marqueurs qui permettent de révéler une série de plusieurs allèles pour chaque locus étudié. Ils sont multi-alléliques et comprennent les marqueurs RFLP, PCR/RFLP, SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) et microsatellites. Il y a aussi les minisatellites, les SNP (Single Nucleotide Polymorphisms). Les microsatellites ou marqueurs SSRs (Simple Sequence Repeats) sont des marqueurs de choix pour la cartographie génétique, la génétique des populations, la caractérisation du germoplasme et la sélection assistée par marqueurs (SAM) du fait de leur codominance et leur très haut niveau de polymorphisme (Yu et al, 1999, Santoni et al 2000). En effet, ils ont été utilisés pour révéler 26 allèles/locus dans un groupe de 100 génotypes chez le soja (Rongwen, 1995). Chez le mais, ils ont montré un polymorphisme extrêmement élevé et une bonne résolution analytique (Matsuoka et al 2002). Les RFLP ont permis la réalisation d’une carte génétique chez des plantes peu polymorphes comme le blé tendre ou la pomme de terre Nelson et al, (1995) cité par Santoni et al,( 2000).Ils présentent certaines qualités d’un bon marqueur génétique. Ils peuvent être monolocus ou multi-locus, codominants, bi ou multi-alléliques et sont capables de marquer toutes les régions du génome (Santoni et al, 2000). Dubreuil et al, (1998) ont identifié des clones ou des lignées chez le maïs en les utilisant. Les marqueurs PCR/RFLP sont utilisés pour des manipulations portant sur l’étude des gènes de résistance aux parasites (Santoni et al, 2000). Les marqueurs SSCP ont servi dans le programme de cartographie de référence du génome du riz (Fukuoka et al ,1994) .Ils ont permis également l’analyse du flux de gènes entre populations de chênes(Bodenes et al,1996). 

Les marqueurs multi-locus, au hasard et dominants

Les marqueurs multi-locus sont fournis par des techniques basées toutes sur la PCR (Santoni et al, 2000). Ce sont principalement les marqueurs RAPD, AFLP, ISSRs. Ces marqueurs 6 révèlent simultanément plusieurs locus, ce qui permet souvent, en peu d’expériences, de caractériser sans ambigüité un génotype. Ils sont utilisés pour réaliser du génotypage rapide ou (fingerprinting/empreintes génétiques) et servent également pour la cartographie génétique et à chaque fois qu’il faut saturer en marqueurs une région particulière du génome (Santoni et al, 2000). Ils permettent, dans des dispositifs génétiques adaptés, d’obtenir une forte densité de marqueurs dans une région précise du génome, au voisinage du gène à cloner (De Vienne, 1998). Les marqueurs AFLP possèdent un degré élevé de reproductibilité et une grande puissance discriminatoire, ils ont permis la caractérisation génétique du sésame (Ali et al, 2000). Les marqueurs RAPD ont pu révéler l’existence d’une variabilité génétique entre les 2 variétés ISRA985 et IT81D-1137 de la collection de l’ISRA dont l’une tolérante à la sécheresse et l’autre sensible (Abaye et al, 2004). I.2. Etapes de base du marquage moléculaire I.2.1 Extraction de l’ADN De nombreuses méthodes existent pour extraire l’ADN génomique des plantes et l’extraction d’ADN peut se faire avec diverses parties de la plante (feuilles fraîches ou séchées, radicule, graine, tige, etc.). Cependant, quelque soit la méthode utilisée, le principe général repose sur la lyse des parois et membranes cellulaires, la lyse des constituants cellulaires autres que l’ADN et la précipitation de l’ADN qui est ensuite purifié (Gueye, 2008). Plusieurs procédés de purification sont disponibles mais le mélange phénol-chloroforme est habituellement le plus utilisé, il est très efficace. Actuellement, il existe des kits commerciaux, prêts à l’emploi, qui permettent de simplifier les procédés de purification (Etienne, 1999).Des techniques simples et peu couteuses ont été utilisées chez le niébé et le sésame (Hosaka, 2004) I.2.2 Quantification des extraits d’ADN La quantification de l’ADN peut se faire sur gel d’agarose ou par spectrophotométrie. Dans le premier cas, on compare la migration des échantillons à analyser à celle des fragments d’ADN de concentration connue. Dans le second cas, la quantité d’ADN est estimée à l’aide d’un appareil photomètre, l’ADN absorbe fortement dans l’ultra-violet à 260nm. Une unité de densité optique à 260nm(DO260) correspond à 50µg/µl pour de l’ADN double brin. Les protéines et le phénol absorbent 7 respectivement à 280nm et 270nm. Pour une solution d’ADN pure, le rapport DO260/DO280 doit être environ 1,8. 

La PCR (Polymerase Chain Reaction)

La Polymerase Chain Réaction est une technique développée en 1983 par Kary Mullis qui fut prix Nobel en 1993. C’est une technique moderne et efficiente permettant d’amplifier une séquence spécifique d’ADN des millions de fois en quelques heures (Gueye, 2008). Elle consiste à amplifier par cycles successifs une séquence donnée d’ADN grâce à une ADN polymérase thermorésistante (la Taq polymérase) et la présence dans le milieu de deux amorces (sens et anti-sens), bordant le fragment que l’on souhaite amplifier. Ce pouvoir d’amplification spécifique d’un locus donné à partir d’une très faible quantité d’ADN initiale a été à la base d’un grand nombre de techniques de marquage moléculaire. (This et al, 2006). Chaque cycle de la PCR comprend une succession de trois phases : -une dénaturation par la chaleur qui sépare les deux brins d’ADN. -une hybridation des amorces (accrochage des amorces sur l’ADN simple brin). -une élongation des brins complémentaires 5’-3’ à partir des amorces par l’ADN polymérase. 

La technique AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)

Elle a été mise au point par la société Keygene basé au Pays-Bas, elle est protégée par un brevet (VOS et al, 1995). L’ADN est hydrolysé après extraction par des enzymes de restriction. Des adaptateurs spécifiques des deux sites de restriction sont ligués aux extrémités des fragments obtenus. L’ADN ainsi préparé est utilisé lors d’une amplification PCR qui utilise deux amorces correspondant aux adaptateurs auxquels sont ajoutés une à trois bases arbitraires en 3’. L’une des deux amorces peut être marquée. Les fragments produits par cette amplification sont séparés par électrophorèse sur un gel d’acrylamide dénaturant. Le gel est alors exposé quelques jours au contact d’un film auto-radiographique. Pour chaque individu, plusieurs dizaines de fragments ou bandes sont matérialisées. Chaque bande s’interprète comme un allèle d’un locus particulier. La révélation au nitrate d’argent est aussi possible si la radioactivité n’est pas utilisée (Ndir, 2008). La combinaison enzyme de restriction x amorces constitue le marqueur. Cette technique présente un certain nombre d’avantages : -seule une faible quantité d’ADN est nécessaire. 8 -l’utilisation de deux amorces correspondant à des adaptateurs permet d’obtenir une bonne reproductivité. -de nombreux fragments amplifiés peuvent être révélés en changeant le couple d’enzymes de restriction ou les bases sélectives. -aucune connaissance particulière de l’ADN génomique n’est requise (Adam et Dron, 1993). 

La technique RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Elle consiste à réaliser une réaction PCR de l’ADN génomique de l’individu étudié en utilisant une amorce courte de 10 nucléotides généralement de séquence arbitraire. L’amorce va s’hybrider à chaque fois que se trouvera dans l’ADN une séquence qui lui est complémentaire. L’amplification est possible chaque fois que la paire d’amorce aura trouvé deux sites d’hybridation proches l’un de l’autre (moins de 2 à3 pb) et en direction opposée sur les deux brins. Si un des deux sites est absent dans un individu, il n’y aura pas d’amplification et un polymorphisme de présence/absence sera observé. Les produits d’amplification obtenus peuvent être séparés par électrophorèse en gel d’agarose (Santoni et al, 2000). Elle est rapide, facilement automatisable et nécessite peu d’ADN. Il n’ya ni digestion de l’ADN, ni hybridation et surtout aucune connaissance préalable n’est requise sur les séquences. Cependant, elle présente parfois des problèmes de reproductibilité (Santoni et al, 2000). Des techniques similaires, AP/PCR ou DAF (DNA Amplification Fingerprinting), utilisant des amorces arbitraires sont très populaires auprès des généticiens dans le domaine végétal.