Structure tridimensionnelle et caractéristiques -chimiques

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TAXONOMIE

La division du genre Trichoderma en espèces a fait l’objet de nombreuses études et de beaucoup de polémiques. Dans le règne vivant les limites de «l’espèce» reposent sur la possibilité de croisement entre individus. Or, les champignons anamorphes du genre Trichoderma, en tant que tels, n’ont pas de reproduction sexuée connue, et ce caractère ne peut donc être utilisé pour leur systématique. On se base alors sur les aspects culturaux et la morphologie des appareils sporogènes (Roquebert, 1996) ainsi que sur le matériel génétique en s’appuyant sur des techniques de biologie moléculaires (Gams et Bissett, 1998).

Si on répertorie succinctement les dates les plus importantes qui ont marqué la systématique des Trichoderma sp., on se rend vite compte que leur positionnement taxonomique n’a pas été chose facile.

En 1794, Persoon décrit le premier Trichoderma sp. et établit 4 espèces.

En 1821, Fries classa les Trichoderma sp. parmi les Gastéromycètes.

En 1860, débutent les controverses sur cette systématique, Tulasne contredit Fries puisqu’il ne trouve pas de forme téléomorphes (sexuées) à ce genre.

En 1871, devant le nombre croissant d’espèces rencontrées, Harz insiste sur l’importance des caractères morphologiques sous microscopie optique (surtout les phialides).

En 1916, Waksman décrit ce qu’il trouve être 6 nouvelles souches de Trichoderma sp. en utilisant des critères macroscopiques, différents de ceux préconisés par Harz.

En 1926, Abbot identifie 4 espèces de Trichoderma selon des critères une fois de plus différents des précédents.

Jusqu’à 1939 le raisonnement d’Abbot reste en vigueur, mais aussi à côté d’identifications totalement indépendantes.

En 1939, Bisby tente de mettre de l’ordre dans ces systèmes en proposant une unique espèce : Trichoderma viridae. Et durant 24 ans, toute espèce fongique à spores vertes était considérée comme étant un Trichoderma sp.

En 1963, les travaux de Gutter et Monbasher mettent fin au système précédant, en démontrant la variabilité des espèces de Trichoderma en fonction des conditions environnementales.

En 1969, conscient de toute cette polémique, Rifai propose une classification «utilisable avec le concept d’« espèces agrégées », basé sur les caractères microscopiques. « Une espèce agrégée est une entité composée de groupement d’espèces très similaires, difficiles à séparer ». Neuf espèces agrégées sont crées (T. aureoviridae Rifai, T. hamatum Bain, T. harzianum Rifai, T. koningii Oudemans, T. longibrachiatum Rifai, T. piluliferum Webster et Rifai, T. polysporum Rifai, T. pseudokoningii Rifai et T. viridae Gray), tout en tolérant une certaine variabilité au sein de chaque espèce agrégée (Rifai, 1969).

En comparaison avec les nombreux précédents, ce système semble le plus facilement utilisable pour la communauté scientifique, d’autant plus qu’il a été amélioré récemment par Bissett (1984, 1991a et b).

En 1991, Bissett propose la notion de « section » pour faire face au nombre croissant d’espèces nouvelles de Trichoderma sp., sans rapport avec les espèces agrégées.

Se basant sur la morphologie des conidiophores et des phialides, il regroupe les espèces agrégées dans 5 sections (Fig. 2) (Trichoderma, Pachybasium, Hypocreanum, Longibrachiatum et Saturnisporum) (Leuchtmann, 1996 ; Landreau, 2001).

Le système taxonomique de Bissett est aussi appuyé, entre autres, par des approches de biologie moléculaire (PCR), pour répondre au positionnement de nouvelles espèces de Trichoderma identifiées (dont les formes téléomorphes1 sont souvent non identifiées) et reste le plus fiable actuellement (Lillard-Roberts, 2004). La méthodologie de cette taxonomie, détaillée dans le chapitre 3 paragraphes 1-6 et 1-7, repose sur des comparaisons de l’aspect morphologique, le profil métabolique, l’examen phylogénétique et la séquence d’ADN avec des bases de données de références internes au laboratoire de Bissett (Canada).

Les espèces de Trichoderma ainsi que leurs rares formes téléomorphes observées sont classées parmi les Ascomycètes (second plus important groupe fongique en nombre d’espèces) du genre Hypocrea (Sugiyama, 1987 ; Kubicek et al., 2003).

Plus de 200 espèces du genre Hypocrea ont été identifiées, mais sont rarement cultivables, et de ce fait peu décrites en termes modernes (http://nt.ars grin.gov/taxadescriptions/keys/Genusoverviw.cfm). Sous certaines conditions, méconnues, les Hypocrea sp. (téléomorphes) se transforment « définitivement » en Trichoderma sp. (anamorphes). On pense alors que l’évolution a conduit à la disparition du mode sexué pour l’établissement d’un genre à reproduction exclusivement asexuée (Roquebert, 1996).

La biologie moléculaire nous révèle aujourd’hui que des espèces de Trichoderma génétiquement différentes, présentent des similitudes morphologiques spectaculaires et leurs caractéristiques se chevauchent ce qui, d’une part explique la longue controverse connue par ce genre auparavant et d’une autre part, montre que les seuls critères morphologiques ne suffisent plus pour une classification incontestable et rigoureuse des formes anamorphes de Trichoderma sp. (Cournut, 1984 ; Sugiyama, 1987).

1 Le cycle biologique (holomorphe fongique) de certaines espèces fongiques comprend un stade sexué (teleomorphe) et un autre asexué (anamorphe). Proposé par Fuckel (1870) et reprise par Weresub et Hennebert (1979), cette terminologie a fini par être reconnue par « The international Code of Botanical Nomenclature » (I.C.B.N.). Ce phénomène biologique s’applique aux Trichoderma sp. (Gams & Bissett, 1998 ; Esser et Lemke, 2001 ; http ://nt.arsgrin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm).

La taxonomie moderne des champignons a aboli l’embranchement des Deuteromycotina2, auquel appartenait le genre Trichoderma. La position taxonomique actuelle des Trichoderma sp. se présente comme suit (selon Bissett, 2004) :

EmbranchementAmastigomycota et/ou Eumycètes

Sous embranchementAscomycotina

ClasseSordariomycètes

OrdreHypocréales

FamilleHypocraceae

GenreHypocrea mitosporique** (Trichoderma)

**Groupe important de champignons hétérogènes ayant pour caractéristique commune l’absence de stade sexué (http ://www. Medicalglossary .org/fungi_ mitosporic _ fungi_ definitions.html).

ECOLOGIE

Grâce à sa grande capacité d’adaptation aux différentes conditions climatiques, le genre Trichoderma est très répandu dans la nature, aussi bien en milieu terrestre que marin (Roquebert, 1996 ; Esposito et Silva, 1998).

En effet, les Trichoderma sp. sont remarquables pour leur croissance rapide et leur capacité à utiliser différents substrats et sont, par conséquent, l’élément majeur dans la mycoflore terrestre et marine (Widden et Abitrol, 1980 ; Kubicek et al., 2003).

Les Trichoderma sp. terrestres se développent quasiment dans tous les sols (forestiers ou cultivés) et sur les végétaux en décomposition. Ils contaminent fréquemment le compost de la culture industrielle des champignons comestibles, mais sont rarement parasites de plantes vivantes (Roquebert, 1996 ; Esposito et Silva, 1998).

Table des matières

Introduction
Chapitre 1 : LES CHAMPIGNONS MARINS ET Trichoderma sp.
1- La mycologie marine
2- Définition et systématique
3- Répartition géographique et biotope
4- Relations biologiques
5- Les champignons du genre Trichoderma
5-1 Morphologie
5-2 Taxonomie
5-3 Ecologie
5-4 Production de métabolites intéressants
Chapitre 2 : LES PEPTAÏBOLS
1- Rappel sur les mycotoxines
2- Position parmi les mycotoxines
3- Définition des peptaïbols
4- Modes de classement
5- Origine biologique
6- Structure tridimensionnelle et caractéristiques -chimiques
7- La Biosynthèse des peptaïbols
8- Bioactivité des peptaïbols
8-1 L’étude du comportement membranaire des peptaïbols
8-2 Les canaux ioniques peptaïbols-induits
8-2-1 Le modèle de «douves de tonneaux »
8-2-2 Le modèle du mécanisme en tapis
8-2-3 Forme des canaux ioniques constitués
8-2-4 Formation des canaux ioniques par les peptaïbols courts
8-3 Facteurs régissant la formation et Le fonctionnement des CI peptaïbols
8-3-1 Facteurs extrinsèques
8-3-2 Facteurs intrinsèques
8-4 Spécificité ionique des canaux membranaires peptaïbols
8-5 Les peptaïbols et les autres toxines: synergie ?
Chapitre 3 : MATERIEL ET METHODES
1- Obtention du matériel biologique
1-1 Coordonnées géographiques des sites de prélèvements
1-2 Technique de prélèvement, de transport et de conservation
1-3 Mise en culture pour l’Isolement des souches
1-4 Isolement des souches
1-5 Conservation des souches
1-5-1 Conservation de très longue durée en cultures congelées
1-5-2 Conservation de longue durée sous huile de paraffine
1-5-3 Conservation de courte durée à température ambiante
1-6 Identification taxonomique des souches par microscopie optique
1-7 Identification taxonomique des Trichoderma sp. par la méthode de J. Bissett
1-7-1 Examen morphologique
1-7-2 Examen métabolique
1-7-3 Examen phylogénétique et séquençage de l’ADN
1-8 Fermentation pour la production des peptaïbols
1-8-1 Fermentation liquide
1-8-2 Fermentation solide
2- Techniques de fractionnement
2-1 Chromatographie sur Couche Mince
2-2 Chromatographie Liquide Basse Pression
2-3 Chromatographie Liquide à Haute Performance
3- Techniques d’Identification structurale
3-1 La Spectrométrie de Masse (SM)
3-1-1 L’analyse des peptaïbols par SM
3-1-2 L’ionisation des peptides par l’Electro-nébulisation
3-1-3 L’analyse des ions générés dans la source
3-1-4 Conditions expérimentales utilisées pour l’analyse SM
3-2 La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de
masse à impact électronique….
3-2-1 L’ionisation par impact électronique IE
3-2-2 L’analyseur à filtre quaripôlaire
3-2-3 Méthodologie de l’analyse
3-2-4 Séparation chromatographique des EITA
Chapitre 4 : PRODUCTION ET ISOLEMENT DES PEPTAÏBOLS
1- Obtention du matériel biologique
1-1 Les sites de prélèvements
1-2 Culture des souches à partir des prélèvements
1-3 Isolement et identification des Trichoderma sp. producteurs de peptaïbols
1-4 Conservation dans la mycothèque et utilisation des souches
1-5 Identification au niveau de l’Espèce
2- Production de peptaïbols
2-1 Optimisation du protocole de production de peptaïbols
2-1-1 Production de la suspension de spores
2-1-2 L’extraction des peptaïbols
2-1-3 Changement du milieu de fermentation
2-1-4 Modification de la VLC
2-2 Validation de l’optimisation
2-3 Bilan de l’optimisation
2-4 Protocole définitif de production de peptaïbols
2-5 Sélection de 4 souches représentatives des 9 trichoderma sp. initiaux
3- Production massive des peptaïbols
4- Purification des peptaïbols par CLHP analytique
4-1 Problèmes rencontrés en CLHP
4-2 Solutions proposées et résultats
4-3 Protocole final adopté pour la CLHP
5- Purification des peptaïbols par CLHP en mode préparatif
Conclusion
Chapitre 5 : IDENTIFICATION STRUCTURALE DES PEPTAÏBOLS
Introduction
1- Identification et séquençage des peptaïbols par spectrométrie de masse
1-1 Principe de séquençage des peptaïbols en SM
1-2 Cas des peptides contenant le résidu Proline
1-3 Le traitement acidolytique en SM
2- Isomérie des acides aminés: résolution par CPG
3- Protocole d’indentification structurale suivi dans notre étude
4- Résultats et discussion
4-1 L’analyse CPG
4-2 Le séquençage ESI-IT-SM des peptaïbols des 4 « souches groupes »
4-2-1 La souche MMS 147
4-2-2 La souche MMS 151
4-2-3 La souche MMS 175
4-2-4 La souche MMS 204
Conclusion
Conclusion générale
Références bibliographiques
Document rapporté
Tome II
Annexe 1 : Spectres CPG-SM-IE de référence
Annexe 2 : Spectres MSn détaillés du séquençage des nouveaux peptaïbols
Annexe 3 : Spectres ESI-SMn des peptaïbols déjà connues