Structure et propriétés de la molécule d’ADN
Structure
L’ADN est constitué de deux chaînes (ou brins) enroulées l’une autour de l’autre en une double hélice de 2 nm (10⁻⁹m) de diamètre. On parle de « structure en double hélice » (Watson et Crick, 1953). Chaque brin d’ADN est composé d’une chaîne de molécules appelées nucléotides. Chaque nucléotide est constitué d’un groupement phosphate, d’un sucre appelé désoxyribose et d’une base azotée . Il existe deux types de bases qui composent les brins d’ADN : les bases PURIQUES: guanine (G) et adénine (A) et les bases PYRIMIDIQUES: cytosine (C) et thymine (T).
Propriétés
Dénaturation de l’ADN
La première propriété de l’ADN est sa sensibilité à la chaleur. Les liaisons hydrogènes qui assurent la structure en double hélice sont sensibles à la chaleur et le chauffage au-delà de 80°C suffit à les rompre on voit alors l’ADN se dénaturer en deux simples brins qui ne sont plus maintenus ensemble. Ces liaisons labiles vont cependant se rétablir si le refroidissement des brins est lent et les deux brins vont se repositionner en respectant les règles d’appariement en sorte que l’on peut retrouver l’ADN natif initial. Par contre, si le refroidissement est brutal, les simples brins sont « figés » et restent sous la forme simple brin.
Règle de complémentarité des bases azotées
L’ADN est constitué de deux brins. A l’intérieur se trouvent les bases azotées qui sont liées de manière complémentaires deux à deux par les liaisons hydrogènes, c’est à dire que l’adénine ne peut se lier qu’à la thymine et la cytosine ne se lie qu’à la guanine.
Réplication de l’ADN
L’ADN est capable de se répliquer, c’est à dire de se recopier fidèlement. L’ADN se scinde en deux brins, chaque brin séparé servant de modèle pour fabriquer un brin complémentaire. On obtient alors deux nouvelles molécules d’ADN, chacune avec un ancien et un nouveau brin.
Principe de l’hybridation in situ
La technique d’hybridation in situ est basée sur le phénomène biologique d’appariement des paires de bases. Les liaisons Hydrogènes entre les bases azotées ne sont pas permanentes et il est possible de les séparer par la chaleur : c’est la dénaturation et de les relier : c’est l’hybridation. En effet, dénaturées par la chaleur, les liaisons Hydrogènes se rompent et les deux brins d’ADN se séparent. Chaque monobrin formé se liera avec son monobrin complémentaire lorsqu’ils sont remis en présence et reformera alors un double brin. En élevant la température jusqu’à la Température de fusion (Tm), on disjoint 50 % environ des liaisons hydrogène qui unissent les brins d’ADN, ce qui dénature partiellement la double hélice. Lorsque la température atteint 95°C, toutes les liaisons hydrogènes sont rompues et la dénaturation du DNA est complète. En refroidissant brutalement, les structures secondaires ne se reforment pas et l’ADN reste dénaturé (si on refroidit doucement, la double hélice se reforme progressivement.
Une sonde qui contient les séquences complémentaires de la séquence cible, ajouté à ce moment peut s’hybrider avec la séquence cible dès que la température descend en-dessous de la Tm. L’attachement de marqueur sur la sonde permet de la localiser spécifiquement et de localiser ainsi la séquence cible qui contient les bases complémentaires .
L’HIS se révèle donc être un outil essentiel en biologie cellulaire, en génétique et en pathologie pour la détection et la localisation de séquences d’acides nucléiques spécifiques (Speel, 1999). Cette possibilité de visualiser directement la répartition spatiale de séquences spécifiques fournit des informations cruciales pour comprendre l’organisation et la fonction des gènes (Rattray et Michael, 1998) .
Préparation de la sonde et son marquage
Choix de la sonde utilisée
Une sonde est un acide nucléique marqué (ADN ou ARN) dont la séquence nucléotidique est complémentaire de l’acide nucléique cible. Le principe d’hybridation repose sur le fait que la séquence nucléotidique de la sonde doit être antiparallèle à celle de la cible : la cible est orientée 3’=>5’, la sonde est orientée 5’=>3’. Les critères de spécificité de la sonde à respecter sont les suivantes :
– Sa séquence nucléotidique doit être complémentaire à la séquence recherchée. Elle ne doit présenter qu’une homologie très faible avec les autres séquences connues.
– La proportion de la sonde en bases azotées Guanine et Cytosine (%GC) doit être inférieure à 55% (Leitch et al. 1994).
– Les sondes longues permettent l’obtention d’hybrides plus stables, cependant, plus la sonde est longue plus le risque d’avoir des appariements non spécifiques augmente. En conséquence, il faut trouver un compromis entre ces deux facteurs. Ainsi dans le cas des oligonucléotides par exemple, il semble que le compromis soit dans l’utilisation de sondes de longueurs comprises entre 20 et 60 paires de base.
La nature de la sonde peut être de 3 types : ADN double brin, oligonucléotides et ARN (Morel et Cavalier, 2001).
– ADN double brin : Ces sondes sont des fragments double brin d’ADN génomique correspondant à des séquences spécifiques déjà clonées ou complémentaires d’ARN. Dans ce cas, il s’agit alors le plus souvent d’obtenir l’ADN complémentaire de la séquence d’un ARN messager (on les appelle donc ADN complémentaire ou ADNc). Cette séquence est publiée dans la littérature ou dans une banque de données.
– Oligonucléotides (ADN synthétique) : Ces sondes sont de courtes séquences d’ADN synthétique simple brin complémentaires de celles de l’acide nucléique cible. Les séquences utilisées sont publiées dans la littérature ou dans les banques de données. Elles sont disponibles commercialement.
– ARN : Ces sondes sont des simples brins d’ARN (ribosondes) résultant de la transcription in vitro d’un morceau d’ADNc cloné dans un plasmide bactérien.
INTRODUCTION |
