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Spectroscopies à l’échelle de la molécule individuelle
Techniques de champ proche
L’invention du microscope à effet tunnel (scanning tunneling microscopy, STM) précède celle du microscope à force atomique (atomic force microscopy, AFM) de quelques années seulement. Leur inventeur commun, Gerd Binning, reçut le prix nobel de physique pour cette invention la même année (1986) qu’il présenta le premier AFM prototypé aux cotés de Quate et Gerber. Ce n’est évidemment pas un hasard si ces techniques furent développées quasi-simultanément, leur fonctionnement étant en de nombreux points similaire. Toutes deux fonctionnent sur le principe d’asservissement d’une grandeur dépendant de la distance sonde-substrat Z sur une valeur de consigne, ce qui permet en translatant la sonde dans le plan XY de construire une image. En AFM et C-AFM, cette grandeur est une force. Un faisceau laser est réfléchi à la surface d’un levier portant en son extrémité une pointe d’apex nanométrique. La déflexion de ce levier correspond quantitativement à l’interaction que la pointe subit avec la surface. Un scanner piezoélectrique (PZT) situé au niveau du bâti module la position de l’échantillon en X, Y et Z . En Z, la déflexion collectée à la photodiode est comparée à la force d’appui (en équivalent tension), et le PZT réajuste la position Z de sorte à maintenir cette force constante via un système électronique d’asservissement. Le réglage de la boucle de rétroaction se fait via des gains proportionnels et intégraux. Ces gains permettent de moduler le temps de réponse du système et sa sensibilité aux faibles écarts de hauteur. La différence entre la mesure et la consigne donne le signal d’erreur, et la correction ré-injectée pour maintenir l’asservissement du système donne le signal 1 Figure I.1 – Principes des montages C-AFM (a) et STM (b) et cartographies de monocouches auto-assemblées obtenues avec chaque technique sur 1)-2) dodecanthiol et 3) rotaxane de topographie. Dans le cas du STM, cette grandeur est un courant. Une différence de potentiel entre la sonde et le substrat est appliquée (tous deux non-isolants). Un courant tunnel dépendant exponentiellement de la distance sonde-substrat et des états de surface est collecté puis comparé au courant de consigne. La boucle d’asservissement active, une image correspondant au signal de régulation de l’asservissement en Z est obtenue, avec son signal d’erreur. L’imagerie est la fonction première de ces techniques dites de champ proche. Cependant, il en existe une autre sur un mode de spectroscopie, où la grandeur de force ou de courant est caractérisée non plus en fonction du déplacement XY, mais en fonction du déplacement en Z.
Principe de la spectroscopie de force
Il s’agit d’un mode particulier où la position en XY reste fixe, tandis qu’en Z, la boucle de rétroaction est momentanément ouverte le temps de collecte du signal. Ainsi, le piezoélectrique applique librement une modulation en Z, typiquement une rampe linéaire, durant laquelle la pointe peut explorer divers régimes d’interaction. Le signal résultant est formé de deux courbes de force/distance : une courbe d’approche qui est liée la déflexion du levier au trajet aller du piézoélectrique, et une courbe de retrait qui est liée à la déflexion au trajet de retour. Figure I.2 – Description schématique d’un cycle d’approche/retrait en spectroscopie de force. La figure I.2 illustre les différents régimes sondés durant ces phases. Lorsque la pointe est loin du substrat (1) aucune interaction n’est sondée. A son approche, un saut au contact peut être observé lorsque le gradient des forces excède la raideur de la pointe. Il est directement lié aux interactions attractives de Van der Waals, particulièrement marquées à l’air (2). Le levier suit la trajectoire imposée par le PZT dans un régime de contact dur jusqu’au seuil de déflexion maximal (3), au delà duquel la trajectoire est inversée après un temps de latence en surface (sur notre schéma égal à 0). Si durant le contact des interactions ont lieu entre la pointe et le substrat, des discontinuités interviennent (4) jusqu’à séparation de la pointe et du substrat(5). En effectuant un quadrillage en XY sur l’échantillon, il devient alors possible de construire une image où à chaque pixel XY est associé une courbe de force, permettant ainsi de dresser des cartographies d’isoforce. Ce mode permet en particulier de discriminer localement des différences de rigidité ou d’élasticité dans le cas de structures complexes : cellules cancéreuses , cellules musculaires, épithéliales, diatomées (micro-organisme marin unicellulaire) , levures, , et d’en déduire des propriétés structurales du matériau . Dans le cas des interactions molécule-or, nous distinguons deux types d’expériences utilisant ce mode qui permettent toutes deux de remonter à ces forces d’interaction. La première consiste à fonctionnaliser la surface par la molécule, et à effectuer ces cycles d’approche/retrait avec une pointe préalablement métallisée, formant ainsi des jonctions or-molécule-or . Il s’agit de la technique utilisée par les équipes couplant force et conductance . Elle présente l’avantage de pouvoir former une jonction de faible dimension, impératif requis aux mesures de conductances, et de relier les mesures à la molécule par l’observation simultanée de deux observables. Du seul point de vue de la spectroscopie de force, cette technique présente l’inconvénient majeur de rendre indissociable l’interaction en molécule unique du reste des interactions. Généralement, ces expériences révèlent des courbes de force noyées dans une série d’interactions provoquées par un grand nombre de molécules, et seule la dernière interaction avant perte de contact électrique peut être attribuée à la rupture d’une liaison. Pour plusieurs raisons, le passage par une fonctionnalisation de la pointe par ajout d’un agent de coupage est préférable en vue d’une quantification plus fiable des interactions.
Forces d’interaction
Les forces d’interaction sont de différentes nature et la classification dépend bien souvent du domaine d’étude (spécifique ou non-spécifique pour désigner des combinaisons d’interactions). Ne seront détaillées dans ce qui suit que celles que nous allons rencontrer dans nos expériences. Van der Waals (FV dW ) : L’origine de ces forces provient de l’observation qu’un système polarisable peut interagir avec d’autres systèmes polarisables générant alors une attraction qui décroît en 1/z6 où z est la distance séparant les deux systèmes. En AFM leur expression se réduit généralement à FV dW (z) = −AHR/6z 2 dans le cas d’une interaction sphère-plan [24], avec AH la constante d’Hammaker et R le rayon de courbure de la pointe. En pratique, ces interactions sont considérées comme non-spécifiques car elles sont observées dans un grand nombre de systèmes et de fonctionnalisations de surface. Au niveau des courbes de force, elles peuvent être responsables d’un saut au contact nettement marqué à l’air sur les courbes d’approche, signe que le gradient de force sur la distance pointe-substrat excède la rigidité du levier. Capillarité (Fcap) : A l’air, la condensation de molécules d’eau physisorbées tant au niveau de la pointe que du substrat mène à la formation d’un film d’eau qui, au point de contact forme un ménisque. La force associée à la rupture de ce ménisque est bien souvent très élevée, et écrante les autres contributions. Tout comme les forces de Van der Waals, dont elles sont issues [25]), celles-ci sont attractives et dépendent fortement de la surface en contact, donc des dimensions de la pointe et de sa rugosité, mais non de la distance pointe-substrat. Un moyen de s’en affranchir est de se placer en milieu liquide. Electrostatiques de double-couche (Fdc) : En milieu liquide, il n’est pas rare de voir apparaître une contribution répulsive issue des charges de surface. L’adsorption d’ions ou les processus de protonation/déprotonation induisent, fonction de leur différence de charge avec la charge du matériau, la formation d’une double-couche. La perturbation de cette double-couche par une surface comme une pointe AFM donne naissance à cette force. La grandeur qui la caractérise est connue sous le nom de longueur de Debye λD, et se retrouve dans son expression sous la forme FD(z) = CRλD exp (−z/λD) avec C une constante dépendant des densités de charge surfaciques de la pointe et du substrat et R le rayon de courbure [26]. Notons que sa validité se limite aux cas où z, R >> λD. Une manière de s’affranchir de cet effet est de se placer à un pH proche du potentiel de charge nulle (PZC) du matériau, ou du pKa des grou- 6 pements ionisables dans le cas où la surface serait fonctionnalisée. Notons également que les charges induites par une fonctionnalisation modulent ce PZC. Répulsives d’hydratation : L’expression de la force électrostatique de doublecouche n’est plus valable à des distances pointe-substrat inférieures à 1-3 nm où le milieu ne peut plus être considéré comme continu. L’origine de cette force est cependant toujours controversée. Dans les possibles origines, le recouvrement de couches de molécules d’eau structurées au niveau des surfaces[27], ou le piégeage électrostatique d’ions en présence d’eau au moment du contact [28] sont mentionnés. L’expression de cette force est de même forme que précédemment, FH = CH exp −z/λH [29], mais les valeurs de λH sont généralement plus faibles que λD, de 0.2 à 1.4 nm. Les force de Van der Waals et électrostatiques de double-couche sont intégrées dans une même équation dans la théorie DLVO (Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek) mais ne tiennent pas compte des forces d’hydratation pourtant présentes dans de nombreux systèmes. Néanmoins, la difficulté d’extraction de chaque composante indépendamment des autres ne nous permettra pas de les dissocier. Nous traiterons donc ces interactions répulsives sous le formalisme de la double-couche, en retenant néanmoins qu’à plus faible distance, d’autres contributions peuvent émerger. Electrostatiques (Fel) : Les deux précédentes forces rentrent dans la catégorie des forces électrostatiques et en sont les composantes majeures en milieu aqueux, mais nous considérons ici le cas où un champ est appliqué, ce qui sera une configuration rencontrée en C-AFM. La force entre deux particules chargées électriquement est décrite par la loi de Coulomb, et est en 1/z2 . Dans le cas d’une interaction sphère-plan où un potentiel V est appliqué entre les armatures, cette force peut être approchée par : Fel(z) = π0R2V 2/z(z + R). A un potentiel de 100 mV et un rayon de courbure à 20 nm, nous obtenons des forces variant de 50 pN à 0.4 pN entre 0.1 et 10 nm. Elongations (Fdep) : Ces forces rencontrées lors du dépliements de macromolécules, tel que notre agent de couplage, sont dues principalement aux interactions inter-chaînes ou aux interactions hydrogènes avec le solvant qui maintiennent sa structure dans une conformation minimisant son énergie interne. Issues de contributions entropiques et enthalpiques intervenant à divers régimes d’élongation, elles se conçoivent comme la force de restauration qu’oppose un polymère à la force appliquée. Les modèles forcedistance qui les décrivent font l’étude de la section suivante. Chimiques (Frup) : Ces forces ont fait l’étude d’un grand nombre de travaux, particulièrement en biologie où la spectroscopie de force a permis de quantifier un grand nombre de systèmes complémentaires, comme les systèmes antigènes/anticorps. Néanmoins, dans de tels systèmes les forces font généralement intervenir des mécanismes de coopération entre liaisons non-covalentes (électrostatique, Van der Waals), et les liaisons covalentes restent peu étudiées. Ces forces dépendent de l’énergie de liaison, de la longueur de liaison dans les coordonnées de réaction, de son temps de vie, et peuvent être modulées en spectroscopie de force par la vitesse de charge. Ce point sera traité plus en détail dans la section suivante. Adhésion : Les forces adhésives regroupent la contribution de l’ensemble des forces mesurées lors d’une discontinuité sur la courbe force-distance. Elles se décomposent comme [26] : Fadh(z) = FV dW (z) + Fcap + Fel + δ(z − zrup)Frup + Fdc(z) Pour n’observer que la seule contribution de Frup, les autres contributions doivent être négligeables. En se plaçant en milieu liquide, en introduisant une chaîne de polymère Poly(éthylène glycol) inerte avec notre substrat et en travaillant à des potentiels de 100 mV, cette condition est réalisée. Nous verrons dans les chapitres suivant que sur un grand nombre de mesures, peu d’événements peuvent en pratique être attribués à la rupture d’un groupement cible. Une distinction supplémentaire est donc faite entre les événements d’adhésion dits spécifiques, et les événements adhésifs non-spécifiques qui regroupent les interactions inconnues non-désirables. L’attribution de la spécificité à un événement n’est pas chose aisée. Elle nécessite un travail statistique sur un grand nombre d’événements, des expériences de contrôles, une connaissance préalable de sa valeur de force ou de son énergie de liaison et de sa longueur dans les coordonnées de réaction. Rajoutons que l’action du levier au même titre que celle du linker (assimilables à des potentiels harmoniques) perturbant le potentiel de la liaison, la valeur de la rupture ne peut être obtenue qu’après extrapolation de sa valeur à l’équilibre thermodynamique par les modèles cinétiques.
Mesures de conductance
Les mesures de conductance peuvent être réalisées en C-AFM ou en STM. La première expérience en MC-BJ (mechanically controlled break junction) a été réalisée par Tour en 1997 [30] sur benzene-1,4-dithiol. En 2003, la technique du STM-BJ (STM – break junction) est proposée par Tao [31] pour la mesure de conductance sur alcanedithiols. Dans le cas de contacts atomiques en STM-BJ, une tension est appliquée entre les armature et une rampe linéaire est imposée au PZT jusqu’à ce qu’un contact électrique entre la pointe et le substrat soit établit. Souvent, une saturation du courant, noté I, est observée. Lorsque la valeur de seuil est atteinte (force d’appui en C-AFM ou distance maximale du PZT en STM), le PZT se rétracte, réduisant la surface en contact jusqu’à n’avoir plus que quelques atomes à la jonction électrique. Lorsque cette configuration est atteinte, des paliers de conductance correspondant à des multiples entier du quantum de conductance G0 apparaissent, le dernier correspondant à la rupture entre deux atomes. Cette technique fonctionne quel que soit le métal. Cependant dans le cas de l’or, les réarrangements des atomes durant ce processus sont courants, et peuvent causer la formation d’un nanofil responsable d’un maintien de la conductance sur des distance supérieures à 0.1 nm. Cette propriété est à l’origine de son utilisation. Dans le cas de jonctions molécule/or, la surface est préalablement fonctionnalisée avec la molécule dont les groupements de part et d’autre assurent le contact. La figure I.3 illustre les différentes étapes pour un cycle d’approche/retrait en STM/C-AFM et la courbe de retrait I(z) correspondant. Elle se décompose en trois parties : 1. I ≈ 0 : la pointe est en dehors du contact et le signal collecté à 0 nA ne comporte que le bruit électronique I.3(1,5), 2. I = Isat : la pointe est en contact I.3 (2), et le courant collecté excède la plage de mesure du convertisseur dans la gamme choisie, la valeur correspond à l’équi- I.3. valent courant de sa tension de saturation. La trajectoire est inversée au delà de 2-5 nm d’indentation (STM) ou à plusieurs nN d’appui (C-AFM). 3. I = ]Isat ; 0] : le courant chute, et la pointe peut soit sonder plusieurs régimes de conduction fonction du nombre de canaux crées par les molécules ou les atomes I.3 (3,4), ou simplement décroitre dans un régime tunnel si aucune jonction n’est crée. Figure I.3 – Description schématique d’un cycle d’approche/retrait en STM/C-AFM. La valeur Isat correspond au courant à saturation pour la gamme de mesure. Au contact, plusieurs molécules peuvent s’être simultanément greffées et durant la phase de retrait, de nouveaux paliers sont observés pour chaque rupture molécule/or. Moins conductrices qu’une jonction métallique, les multiples de G0 sur ces jonctions sont faibles : de 10−2 jusqu’à 10−5 G0 et moins [32], [33], [34]. Les courants mesurés étant de l’ordre du nA, un amplificateur possédant plusieurs gammes de mesures est utilisé. Les jonctions métal/molécule et métal/métal n’intervenant pas aux mêmes ordres de grandeur, elles ne sont dans notre cas jamais mesurées simultanément. Par ailleurs, il existe d’autres techniques qui jouent à la fois sur la modulation de la rampe par les séquences d’arrêt/retrait différées et sur l’asservissement. Dans la méthode I(s) proposée par Nichols [35], le contact atomique or-or n’est pas établi. Un gap de largeur ∆s est formé, et la pointe est rétractée à partir du courant de consigne en STM dont les courbes dln(I)/ds permettent d’associer la réponse I en distance s0 + ∆s (avec I0 = I(s0) le point de contact or-or extrapolé). l’asservissement est maintenu en X,Y et Z sans réaliser de contact . Dans le mode I(t), aucun mouvement de pointe n’est effectué, et le courant est simplement collecté pendant que la boucle de rétroaction est ouverte. Ces méthodes nécessitent un faible taux de recouvrement en molécules. En réalité, ce sont les fluctuations thermiques qui induisent la formation d’une jonction, et une très bonne stabilité mécanique du montage est requise
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