Sacrifice des animaux et prélèvements des organes 

 Sacrifice des animaux et prélèvements des organes 

À la fin des 9 premières semaines de régime et juste avant le commencement du protocole d’exercice, un premier lot de souris contrôle et HFS ont été sacrifiées pour le représenter le temps 0 d’exercice (T0, Ctrl n=3 et HFS n=5). Les souris sous protocole d’exercice ont été sacrifiées après une semaine (T1, Ctrl n=3 et HFS n=5), deux semaines (T2, Ctrl n=3 et HFS n=5), trois semaines (T3, Ctrl n=3 et HFS n=5), quatre semaines (T4, Ctrl n=3 et HFS n=5) et sept semaines (T7, Ctrl n=3 et HFS n=5) d’exercice volontaire. Dans les mêmes temps, des souris sédentaires ont également été sacrifiées (à T1, Ctrl n=3 et HFS n=3 ; à T2, Ctrl n=3 et HFS n=3 ; à T3, Ctrl n=3 et HFS n=5 ; à T4, Ctrl n=3 et HFS n=6 ; et à T7, Ctrl n=3 et HFS n=9). Immédiatement après sacrifice, l’ensemble des tissus adipeux épididymal, souscutané, périrénal, mésentérique et brun interscapulaire ont été prélevés. Le foie, le muscle gastrocnémien, le soléaire et le cœur ont également été collectés. Les tissus ont été fixés dans la formaline pour une analyse histologique et/ou congelés dans l’azote liquide et conservés à – 80°C pour une analyse biochimique. À noter également que durant la collecte des tissus, le tissu adipeux épididymal a été séparé en trois morceaux de taille environ égale. Un premier morceau directement placé dans l’azote liquide et à -80°C, un second morceau incubé pendant 30 minutes à 37°C dans une solution de PBS avant congélation, tandis que le dernier morceau était lui aussi incubé 30 minutes à 37°C dans une solution de PBS contenant de l’insuline (20mg/ml). Cette manipulation avait pour objectif de réaliser une stimulation à l’insuline in vitro du tissu adipeux épididymal afin d’en évaluer son insulino-sensibilité dans les différents groupes de souris. Matériels et méthodes 111 IV Analyse biochimique et biomoléculaire:

Mesure de l’expression de gènes par RT-qPCR 

Extraction des ARN totaux

L’extraction des ARN totaux des tissus adipeux épididymal, sous-cutané et brun a été réalisée à partir d’un morceau de tissu congelé d’environ 40 mg homogénéisé à l’aide d’un robot à billes (Retsch) dans 1 mL de solution de Trizol (Thermofisher Scientific, 15596026). Le Trizol permet de lyser le tissu, de dénaturer les nucléases endogènes tout en préservant l’intégrité des molécules d’ADN et d’ARN de l’échantillon. On ajoute ensuite au broyat du chloroforme qui permet d’obtenir après de une centrifugation de 15 minutes à 12000g et à 4°C une solution triphasée. On retrouve une phase inférieure dite organique et contenant l’ADN et les protéines, une interphase et une phase supérieure dite aqueuse contenant l’ARN. La phase aqueuse est ensuite transférée minutieusement dans un nouveau tube contenant un volume d’isopropanol afin de faire précipiter les ARN. Après 10 minutes d’incubation à température ambiante, les tubes sont alors centrifugés pendant 15 minutes à 12000g et à 4°C. Un maximum de surnageant est ensuite enlevé avant de laver le culot avec de l’éthanol à 75% afin de purifier les ARN et d’éliminer les acides nucléiques doubles brins susceptibles de rester. Les échantillons sont vortexés puis centrifugés comme précédemment à 12000g. De nouveau, le surnageant est retiré puis les tubes sont laissés à sécher quelques minutes à température ambiante. Pour finir, les ARN sont élués dans un tube stérile avec 20-30µL d’eau ultrapure RNAse free et conservés à -80°C.

Détermination de la qualité d’extraction et de la concentration en ARN

À l’aide d’un lecteur de densité optique (NanoDrop 2000, Thermo Scientific), a été mesurée l’absorbance à 260 et 280 nm de toutes nos solutions d’ARN après avoir calibré l’appareil avec de l’eau distillé. L’absorbance à 260nm (A260) est représentative des ARN tandis que celle à 280 nm (A280) est caractéristique des protéines. Un rapport A260/A280 compris entre 1.7 et 2 est un indicateur d’une bonne qualité d’extraction et de non contamination de l’échantillon par les protéines. Le logiciel NanoDrop détermine automatiquement une concentration en ARN pour chaque solution exprimée en µg/µL.

La transcription inverse (Reverse Transcription, RT) 

Dans des tubes stériles sont mis en présence 5µg d’ARN totaux avec des random hexamers (Invitrogen, Thermofisher Scientific, N8080127), des oligodT (Invitrogen, Thermofisher Scientific, 18418012) et des dNTPs (GeneAmp, Thermofisher Scientific, N8080261). Les dNTPs sont les désoxyribonucléotides utilisés pour la synthèse des brins d’ADNc, les random hexamers sont les amorces qui s’hybrident avec l’ARN afin de permettre ensuite la fixation de la reverse transcriptase. Les OligodT quant à eux, ont la même finalité que les random hexamers, à savoir la formation d’une structure double brin, à la différence qu’ils sont spécifiques de la queue polyA retrouvée uniquement sur les ARN messagers (ARNm). Leur présence permettra une amplification future spécifique des ARNm. 1.4) La réaction de PCR : Les gènes d’intérêt ainsi que le gène S18 (étalon interne-housekeeping gene) ont été amplifiés grâce à des amorces spécifiques. De plus, un étalon interne, gène dont le niveau d’expression n’est pas affecté par le conditionnement (ici le régime HFS ou l’exercice physique) a été utilisé. Ainsi, toute variation d’expression de l’étalon interne entre deux échantillons donnés aura probablement pour origine un artefact méthodologique. Il a donc été comparé entre les échantillons, les niveaux d’expression de nos gènes d’intérêt normalisés par rapport au niveau d’expression de l’étalon interne (S18)