Résolution enzymatique d’alcools racémiques dans des solvants « verts » 

Actuellement, l’application des processus chimiques à grande échelle nécessite l’utilisation de produits et de processus à faible impact environnemental car la protection de la planète est devenue une priorité capitale. Dans ce cadre, la biocatalyse est une des voies permettant de répondre à ces impératifs. Cependant, dans de nombreuses réactions biocatalysées, l’utilisation de solvants organiques est malheureusement nécessaire1 . En effet, les solvants organiques, s’ils sont effectivement toxiques et néfastes pour l’environnement, ils ont, par contre, permit d’élargir la palette d’intervention des biocatalyseurs et ouvert la voie à de nombreuses applications en synthèse organique2 . Des solvants alliant respect de l’environnement et propriétés intrinsèques aux solvants organiques seraient l’idéal. Tel est le cas des solvants 2-méthyltétrahydrofurane (MeTHF) et cyclopentyl méthyle éther (CPME) qui sont considérés comme «solvants verts»3,4. Des travaux relativement récents ont montré que ces solvants peuvent être des milieux prometteurs pour les réactions biocatalysées5 . Cependant, à notre connaissance, peu de recherches ont été effectuées sur l’influence de ces solvants sur les lipases, enzymes les plus utilisées en chimie organique. C’est de ce constat que nous avons décidé de développer cette problématique, objet de la deuxième partie de ce travail. Pour ce faire, nous avons étudié la résolution enzymatique de quelques alcools racémiques industriellement intéressants dans les solvants verts mentionnés ci-dessus, catalysée par des lipases largement employées au niveau industriel. Les résultats obtenus avec ces solvants ont été comparés avec d’autres solvants organiques plus classiques comme le toluène et le t-butyle méthyle éther (MTBE). Les trois modèles de substrats étudiés dans cette partie possèdent des caractéristiques structurelles différentes concernant le groupe fonctionnel alcool : (i) le (±)-menthol, un alcool secondaire cyclique et stériquement encombré ; (ii) le (±)-sulcatol, un alcool secondaire linéaire et (iii) le (±)-α-cyclogeraniol, un alcool primaire possédant un stéréocentre stériquement encombré en position α. D’autre part, dans l’intention de vérifier si les stratégies couramment utilisées pour améliorer l’activité enzymatique peuvent être exploitées avec ces solvants verts, le rôle de la formulation enzymatique par la lyophilisation et l’immobilisation de l’enzyme, et de l’addition de liquides ioniques au milieu réactionnel, ont été évalués. L’influence de l’activité de l’eau dans le système réactionnel, de la longueur de la chaîne du donneur d’acyle et de la température ont été également étudiés.

Criblage de lipases

Dans un premier criblage, une série des lipases commerciales la CRL, la lipase AK, la CALB, la lipase PS, la lipozyme et la LPP ont été testées dans l’acylation enzymatique des alcools racémiques par l’acétate de vinyle. Les réactions ont été menées dans les deux solvants verts (MeTHF et CPME) et, à titre de comparaison, dans deux autres solvants classiques (toluène et MTBE). Les conversions des alcools racémiques présentées dans le tableau 2.1 sont mesurées après 24 h de réaction et l’énantiosélectivité a été calculée à 20% de conversion. Comme on peut le voir dans le tableau, l’activité enzymatique dépend de la lipase et du solvant organique.Parmi toutes les lipases testées pour la transestérification du (±)-menthol, la CRL est la meilleure en termes de conversion, où des valeurs élevées ont été observées avec des temps de réaction plus courts. Cependant, l’énantiosélectivité obtenue est faible. La lipase AK a présenté la meilleure énantiosélectivité mais avec peu d’activité et taux de réaction. La CALB, la lipase PS, la lipozyme et la PPL sont inactives, même après 72 h de réaction aucun produit n’a été détecté pour la LPP. D’autre part, l’activité la plus élevée de la CRL est observée dans le MTBE. Dans le CPME l’activité est relativement bonne et est similaire à celle dans le toluène. Dans MetTHF, l’activité est modérée. Concernant l’énantiosélectivité de la CRL, celle-ci est bonne (facteurs E d’environ 100) pour les trois solvants CPME, MetTHF et MTBE et faible dans le toluène. Remarquons que pour la lipase AK, si les taux de conversion sont faibles, les énantiosélectivités observées sont bonnes à excellente dans le CPME (E=232). Pour la transestérification du racémique sulcatol, la CALB, la CRL et la lipase AK ont montré des vitesses initiales de réaction très élevées ainsi que de très bonnes conversions. La lipase PS et le lipozyme ont présenté des activités modérées, et avec la LPP une très faible activité a été observée. Concernant l’énantiosélectivité des lipases, la CALB a donné le meilleur facteur E (E>1000 dans le MTBE). Les autres lipases ont présenté une énantiosélectivité modérée à l’exception de la CRL dont l’énantiosélectivité est très faible quel que soit le solvant (E<8). D’autre part, et pour l’évaluation de l’effet du solvant, les lipases testées ont montré une activité et énantiosélectivité dans le CPME et MetTHF, similaires à celles observées dans le MTBE et le toluène. En revanche, dans les deux solvants verts, l’énantiosélectivité de la CALB est excellente et est nettement supérieure à celle observée dans le toluène. Dans l’acylation du racémique α-cyclogeraniol, les deux énantiomères ne sont pas discriminés et l’énantiosélectivité de l’ensemble des lipases testées reste faible à modérée quel que soit le solvant utilisé. Notons également que, contrairement aux autres lipases, la lipozyme et la LPP montrent des activités négligeables.

 Influence de l’activité de l’eau (aw)

Il est connu que, d’une manière générale, l’eau peut influencer la performance de l’enzyme dans les solvants organiques6,7 . Un ensemble d’expériences d’acylation enzymatique des alcools racémiques dans le MeTHF et CPME a été effectué à 25 °C à différentes valeurs de l’activité de l’eau (aw) comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes. Chapitre 3. [Résultats et discussion] 102 L’effet de l’aw sur l’activité des lipases dans la transestérification du menthol par la CRL, du sulcatol par CALB et du α-cyclogeraniol par lipase AK été évalué (figure 2.1). Avec les deux solvants verts, les activités les plus élevées sont obtenues pour une valeur d’aw de 0 ,06 et diminuent au fur et à mesure que celle-ci augmente. Dans le cas de la transestérification du αcyclogeraniol par lipase AK dans le MeTHF, la diminution a été très forte (conversion de 3% pour aw = 0,84). Ces résultats montrent que si une quantité minimale d’eau est nécessaire au fonctionnement de la protéine, au-delà, celle-ci pourrait avoir un impact négatif sur l’activité enzymatique. Ces résultats sont en accord avec à ceux de la littérature8 . En effet, l’eau libre dans le système réactionnel va rentrer en compétition avec l’alcool et provoquer l’hydrolyse du substrat ester.