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Inventaire des Gastéropodes
Les Gastéropodes forment la plus importante classe des Mollusques avec 90 000 espèces connues (Leveau, 2001). Les méthodes d’identification décrites par Bonnet et al. (1990) et Chevalier (1992) se basent sur le nombre de bandes spirales au niveau des coquilles ainsi que la couleur et la forme des coquilles.
Les Gastéropodes sont caractérisés par une coquille univalve spiralée, un pied aplati dont la face inférieure sert à la locomotion, une tête bien distincte où s’ouvre la bouche et portant des organes sensoriels, et par une masse viscérale située dorsalement, enveloppée par le manteau et protégée par la coquille (Gaillard, 1991). La classe des gastéropodes se divise en 3 sous-classes (Gaillard, 1991 ; Grizimek & Fontaine, 1973) qui sont :
Les Pulmonés, qui constituent la quasi-totalité des Gastéropodes, avec ou sans coquille, habitant les domaines terrestres et les eaux douces (Gaillard, 1991). Ce sont les seuls Mollusques bénéficiant d’une respiration pulmonaire. Ils sont fréquemment hermaphrodites (Grizimek & Fontaine, 1973).
Les Prosobranches représentent la quasi-totalité des Gastéropodes marins à coquille (Gaillard, 1991). Ils correspondent à la description du Gastéropode typique, à coquille spiralée ou non, et dissymétrique dans son anatomie (Grizimek & Fontaine, 1973).
Les Opisthobranches constituent la totalité des Gastéropodes marins adaptés à la vie benthique littorale ou à la vie pélagique (Gaillard, 1991). Certains possèdent une coquille, mais la grande majorité a un aspect limaciforme (Grizimek & Fontaine, 1973).
L’inventaire c’est fait par la collecte de Gastéropodes terrestres dans différents écosystèmes terrestres, qui ont été ramené au laboratoire pour identification et dénombrement.
Durant la période allant du mois de Décembre 2010 jusqu’au mois de Mai 2011, un relevé par mois a été établis dans les différents sites d’étude.
Dosage de l’acétylcholinestérase
Le dosage de l’AChE a été effectué selon la méthode d’Ellman et al. (1961) décrite précédemment (Sifi et al., 2007). Cette méthode consiste à fournir à l’enzyme un substrat, l’acétylthiocholine (ASCh), dont l’hydrolyse catalysée libère de la thiocholine (SCh) et de l’acide acétique. La quantité de thiocholine libérée agit avec l’acide 5-5’ dithiobis-2- nitrobenzoïque (DTNB) forme un complexe de couleur jaune dont l’intensité est lue à une longueur d’onde de 412 nm. La mise au point d’un réactif spécifique des groupements thiols, le DTNB a permis la réalisation d’un protocole qui utilise comme substrat de la réaction un dérivé soufré de l’acétylcholine, dont l’hydrolyse libère des groupements sulfhydriques quantifiable par spectrophotométrie. Les fragments de tête sont homogénéisés pendant quelques secondes dans 1 ml de solution détergente [38,03 mg EGTA (acide éthylène glycol-bis, β-aminoéthyl éther NNN’N’ tétra acétique), 1ml Triton X 100% 5,845 g NaCl, 80 ml tampon tris (10 mM, pH 7)] à l’aide d’un homogénéiseur à Ultrasons, puis centrifugés (9000 tours /mn pendant 15 mn) ; le surnageant récupéré servira pour la mesure de l’activité de l’AChE. Celle-ci est déterminée comme suit :
Une fraction aliquote de 100 µl de surnageant sont additionnées à 100 µl de DTNB (0,1 M, pH 8) [(39,6 mg de DTNB, 15 mg CO3HNa) dans 10 ml du Tris (0,1 M, pH 7)] et 1 ml du tampon Tris (0,1 M, pH 7) ; 3 à 5 minutes sont nécessaires pour épuiser la réaction spontanée. 100 µl du substrat Acétylthiocholine iodide (118 mg d’acétylthiocholine dans 5 ml d’eau distillée) sont ajoutés. La lecture des densités optiques s’effectue à 412 nm toutes les 4 minutes pendant 20 mn contre un blanc où le surnageant a été remplacé par un volume équivalent de solution détergente. Les résultats obtenus ont été exprimés en µM/mn/mg de protéines.
Dosage du glutathion
Le glutathion est un tripeptide constitué d’acide glutamique, cystéine et glucine. Le GSH est requis pour l’activité de plusieurs enzymes, il participe avec le glutathion réductase à l’établissement de ponts disulfures dans de nombreuses protéines et dans des hormones polypeptides et prend part au métabolisme des xénobiotiques présents dans la majorité des tissus. Le glutathion joue un rôle principal dans la réduction de tout peroxyde organique, en présence de glutathion peroxydase (GPx).
Le glutathion est extrait de l’hépatopancréas et dosé selon la méthode de Weckberker & Cory (1988) écrite précédemment (Zaidi & Soltani, 2011) . Cette méthode repose sur la mesure de l’absorbance de l’acide 2-nitro 5-mercapturique, résultant de la réduction de l’acide 5-5’-dithio-bis-2-nitrobénzoique (DTNB) (réactif d’Ellman) par les groupements thiol (-SH) du glutathion. Le dosage s’effectue après homogénéisation des échantillons dans 1ml d’une solution d’éthylène diamine tétra acétique (EDTA) à 0,02 M [7,4448 g EDTA dans 1000 ml d’eau distillée] à l’aide d’un ultrason. Afin de protéger les groupements thiol du glutathion l’homogénat doit subir une déprotéinisation par l’acide sulfosalicylique (ASS) à 0,25% [0,25 g d’ASS dans 100 ml d’eau distillée] où 0,2 ml du ASS sont additionnés à 0,8 ml d’homogénat. Le mélange est agité et laissé pendant 15 mn dans un bain de glace, puis centrifugé à 1000 tours/mn pendant 5 mn.
Une fraction aliquote (500 µl) du surnageant récupéré est ajouté à 1ml du tampon tris-EDTA (0,02 M, pH 9,6) [63,04 g Tris, 7,4448 g EDTA et 1000 ml d’eau distillée] et 0,025 ml de DTNB (0,01 M) [3,96g DTNB dans 1000 ml méthanol absolu]. Le mélange est laissé pendant 5 mn à température ambiante pour la stabilisation de la couleur, contre un blanc où les 500 µl du surnageant sont remplacés par 500 µl eau distillée. La lecture des densités optiques s’effectue à 412 nm dans un spectrophotomètre.
Présentation de l’insecticide et traitement
Présentation de l’insecticide : L’Actara est insecticide découvert par la société Ciba (maintenant Syngenta AG) en 1991 (Senn et al., 1998). Cet organophosphoré fait partie de la classe des néonicotinoïdes ; ces derniers fonctionnent comme l’acétylcholine un neurotransmetteur, et se fixent sur son récepteur au sein des synapses des cellules nerveuses modifiant ainsi l’influx nerveux. L’actara a un large spectre d’action sur de nombreuses cultures. Il est utilisé pour éliminer les pucerons et les doryphores. Il a une formulation granulée avec 25% de thiaméthoxame (l’ingrédient actif) . Une fois les insectes se nourrissent sur la plante ou entrent en contact avec le thiaméthoxame, l’alimentation est irréversiblement arrêtée.
Traitement : Pour chaque traitement insecticide, des boites en plastiques (de 2 litres de capacité chacune) ont été placées au niveau du laboratoire. L’ouverture de chaque boite a été bien couverte avec un tissu filet fixé avec une bande d’élastique. Des individus d’H. aperta ont été récoltés, durant les saisons hiver et printemps, des différents sites étudiés, puis ramené au laboratoire. Une analyse biométrique nous a permis de classer les individus par corpulence. Des lots de 10 escargots, de taille similaire (13,46 ± 2,23 mm de hauteur de coquille pour un diamètre de coquille de 22,37 ± 2,49 mm, avec un poids moyen de 4,28 ± 1,49 g) sont placés dans les différentes boites.
Des essais préliminaires ont été réalisés et deux doses : 200 mg et 400 mg de matière active par litre d’eau distillée ont été retenues dans nos essais. Des feuilles de laitue fraîches sont plongées dans la solution de l’insecticide, puis séchées à l’air libre, durant 2 heures, et présentées aux animaux, préalablement mis à jeun. L’opération est renouvelée tous les jours.
L’essai est conduit avec trois répétitions. Les analyses biochimiques (biomarqueurs, protéines) ont été faites après 96 heures de traitement
Table des matières
1. INTRODUCTION
2. MATERIEL ET METHODES
2.1 Présentation des sites d’études
2.2 Analyses physico-chimique des sols
2.2.1 Texture
2.2.2 Matière organique
2.2.3 pH eau
2.2.4 Conductivité électrique
2.2.5 Calcaire
2.2.5.1 Calcaire total
2.2.5.2 Calcaire actif
2.2.6 Porosité
2.2.6.1 Densité apparente
2.2.6.2 Densité réelle
2.3 Inventaire des Gastéropodes
2.4 Indices écologiques
2.5 Mesure in situ des biomarqueurs
2.5.1 Dosage de l’acétylcholinestérase
2.5.2 Dosage du glutathion
2.6 Extraction et dosage des protéines
2.7 Modèle biologique testé
2.7.1 Taxonomie
2.7.2 Morphologie
2.7.3 Anatomie
2.7.4 Reproduction
2.8 Présentation de l’insecticide et traitement
2.9 Traitement statistique des données
3. RESULTATS
3.1 Analyses physico-chimique des sols
3.2 Inventaire des Gastéropodes dans les sites d’études
3.3 Indices écologiques
3.4 Mesure in situ des biomarqueurs
3.5 Effet en laboratoire de l’Actara sur les biomarqueurs chez H. aperta
4. DISCUSSION
4.1 Inventaire des Gastéropodes terrestres
4.2 Indices écologiques
4.3 Mesure in situ des biomarqueurs
4.4 Effets du traitement insecticide
5. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
6. RESUMES
7. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
