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Moyen d’étude des polyphénols
Préparation des échantillons
Les plantes étant solides sont généralement soumises à un broyage ou une homogénéisation, lesquelles peuvent être précédés par un séchage ou par une lyophilisation. Le matériel végétal est soumis par la suite à une extraction. C’est la principale étape de récupération et d’isolation des composés phénoliques bioactifs à partir du matériel végétal (Stalikas, 2007).
Extraction des composés phénoliques
L’extraction solide-liquide et liquide-liquide sont les techniques les plus communément utilisées pour l’extraction des polyphénols à partir des plantes, essentiellement à cause de leur facilité, leur efficacité et leur large gamme d’applications (Stalikas, 2007). La plupart des phénols simples présents dans la vacuole peuvent aisément être extraits par des alcools (comme le méthanol, éthanol) et l’acétone. Cependant, les acides phénoliques extrêmement polaires (acide benzoïque, cinnamique) peuvent ne pas être entièrement extraits par ces solvants organiques purs, des mixtures d’alcool-eau ou acétone–eau sont recommandées. Les solvants les plus apolaires (dichlorométhane, chloroforme, hexane, benzène) conviennent à l’extraction des composés non polaires (les huiles et la chlorophylle). (Vermerris et al. , 2006). Les formes condensées de composés phénoliques posent également des problèmes d’extraction. Si les tannins sont encore correctement extraits par des mélanges acétone/eau, ça ne peut être le cas pour les phénols insolubilisés au niveau des parois pecto-cellulosiques, et dans la cutine ou la subérine. On peut alors avoir recours à des hydrolyses chimiques (acides ou alcalines) ou enzymatiques (par exemple sous l’action d’estérases d’origine bactérienne) des parois cellulaires, permettant de libérer les composés phénoliques avant de les analyser et de les doser. Dans les cas extrêmes comme celui de la lignine, l’extraction n’est possible qu’après dégradation oxydative (par exemple sous l’effet du peroxyde d’hydrogène) qui va entrainer une dépolymérisation et une solubilisation progressive. Il est alors bien évident que les analyses ne portent plus sur les composés natifs, mais sur leurs produits de dégradation (Macheix et al. , 2005)
Après l’élimination de l’alcool par évaporation sous vide, il est ensuite nécessaire de purifier l’extrait global ainsi obtenu, d’abord en éliminant les pigments chlorophylliens et caroténoïdes (extraction à l’éther de pétrole), puis en extrayant les composés phénoliques avec un solvant de polarité intermédiaire comme l’acétate d’éthyle. La plupart des phénols se retrouvent alors dans ce solvant, qu’il est ensuite aisé d’éliminer sous vide afin de transférer finalement dans le méthanol, la fraction phénolique correctement purifiée. Cette fraction pourrait ensuite être utilisée pour des analyses qualitatives et quantitatives (Vermerris et al. , 2006).
Séparation, dosage et identification des composés phénoliques
Dosage des composés phénoliques par leurs spectres d’absorption
Le dosage des composés phénoliques utilise très fréquemment leur spectre d’absorption, soit dans le visible pour les anthocyanes, soit dans l’UV pour la plupart des autres composés, en choisissant pour chacun d’eux la longueur d’onde d’absorption maximale (Geirer, 1985). C’est sur ce principe que reposent la plupart des détecteurs qui équipent les appareils de chromatographie, comme la chromatographie liquide à haute performance. La concentration du composé phénolique en solution est déduite en utilisant la loi classique de Beer-Lambert qui lie cette concentration C (en mol/L) à l’absorbance (A) mesurée sur le spectre d’absorption :
A = ε C d
Où ε est le coefficient d’extinction du composé considéré à la longueur d’onde utilisée pour la mesure, et d représente la longueur de la cuve de mesure (en cm).
Dosage des flavonoïdes
La teneur totale en flavonoïdes des extraits végétaux peut être estimée par une méthode calorimétrique, la méthode du trichlorure d’aluminium (AlCl3). La quercétine peut être utilisée comme composé de référence afin de réaliser la courbe d’étalonnage (Vermerris et al. , 2006). Les flavonoïdes donnent avec le chlorure d’aluminium des chélates colorés en jaune.
Dosage total des composés phénoliques totaux
Il n’existe aucune méthode permettant de doser de manière satisfaisante et simultanée l’ensemble des composés phénoliques présents dans un extrait végétal non purifié. Néanmoins, une estimation rapide de la teneur en phénols totaux peut être obtenue par différentes méthodes, en particulier par utilisation du :
Réactif de Folin-Ciocalteu
Bleu prussien
Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I : PRESENTATION DE TERMINALIA MANTALY
I.1. Systématique
I.2. Description
I.2.1. Feuilles
I.2.2. Fleurs
I.2.3. Fruit
I.3. Répartition géographique et habitat
I.4. Chimie
I.5. Propriétés pharmacologiques
I.5.1. Activité antibactérienne
I.5.2. Activité Antiplasmodique
I.5.3. Activité antimycosique
I.6. Emplois
I.7. Toxicité
CHAPITRE II : RAPPELS SUR LES POLYPHENOLS
II.1. Définition
II.2. Synthèse des polyphénols
II.3. Classification
II.3.1. Les non flavonoïdes
II.3.1.1. Les acides phénoliques
II.3.1.2. Les stilbénes
II.3.1.3. Les lignanes et les lignines
II.3.1.4. Les coumarines
II.3.1.5. Les Xanthones
II.3.2. Les flavonoïdes
II.3.2.1. Les iso-flavonoïdes
II.3.2.2. Les néoflavonoïdes
II.3.2.3. Les flavonoïdes au sens strict
II.3.2.3.1. Les flavones
II.3.2.3.2. Les flavonols
II.3.2.3.3. Les flavanones
II.3.2.3.4. Les chalcones et les aurones
II.3.2.3.5. Les flavanols
II.4. Rôle biologique
II.5. Moyen d’étude des polyphénols
II.5.1. Préparation des échantillons
II.5.2. Extraction des composés phénoliques
II.5.3. Séparation, dosage et identification des composés phénoliques
II.5.3.1. Dosage des composés phénoliques par leurs spectres d’absorption
II.5.3.2. Dosage des flavonoïdes
II.5.3.3. Dosage total des composés phénoliques totaux
DEUXIEME PARTIE : ETUDE EXPERIMENTALE
CHAPITRE I : MATERIEL ET METHODES
I.1. Matériel et réactifs
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2. Matériel de laboratoire
I.1.3. Principaux réactifs
I.2. Méthodes
I.2.1. Extraction et fractionnement
I.2.1.1. Extraction
I.2.1.2. Fractionnement
a) Obtention de la fraction dichlorométhanique
b) Obtention de la fraction d’acétate d’éthyle
c) Obtention de la fraction aqueuse
I.2.2. Screening phytochimique
I.2.2.1. Recherche des alcaloïdes
I.2.2.2. Recherche des saponosides
I.2.2.3. Recherche des tanins
a) Réactions de mise en évidence des tanins
b) Réactions de différenciation des tanins
I.2.2.4. Recherche des flavonoïdes
I.2.2.5. Recherche des hétérosides cardiotoniques
I.2.2.6. Recherche des anthracénosides
I.2.2.7. Recherche des stérols et des triterpènes
I.2.3. Dosage des polyphénols totaux
I.2.4. Dosage des flavonoïdes
CHAPITRE II : RESULTATS
II.1. Rendements
II.2. Screening phytochimique
II.3. Dosages
II.3.1. Les Polyphénols totaux
II.3.2. Les Flavonoïdes
CHAPITRE III : DISCUSSION
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
