Reconcentration directe des peptides sur ZipTipTM

Protocoles de reference : Préparation des échantillons 

Dans un premier temps, la préparation des échantillons et leur traitement ont été mis au point sur du stratum corneum plantaire (SCP) afin de privilégier l’étude des peptides et non pas des protéines comme on peut le faire classiquement. En effet, ce type de matrice est disponible en grande quantité. Il s’agit d’échantillons provenant de cornes de pieds obtenues par prélèvement par des pédicures sur des sujets sains. Pour extraire les peptides endogènes du tissu, différents tampons ou solvants ont été utilisés en parallèle afin de comparer leur efficacité d’extraction.

Dans la mesure où l’on ne veut extraire que les peptides et non les protéines, les solvants choisis sont des solvants doux sans adjonction de composés dénaturants pour rester compatible avec l’analyse par spectrométrie de masse : • Tampon phosphate (PBS) 10mM • Tampon (EDTA) 5mM • Tampon (Tris) 0.5M pH=6.8 • Solution aqueuse de chlorure de sodium (NaCl) 2M • Solution aqueuse d’acide trifluoroacétique (TFA) 0.1% (v/v) • Méthanol (MeOH) acidifié par du TFA (MeOH/H2O/TFA 80/20/0.1, v/v/v) • Solution aqueuse d’acide formique (AF) 1% • Méthanol acidifié par de l’AF (MeOH/H2O/AF 80/20/1, v/v/v).

Fractionnement des peptides suivi de leur reconcentration sur ZipTipTM Protocoles de référence :

Suite au fractionnement des peptides sur les concentrateurs, 3 fractions sont obtenues. La fraction inférieure à 5kDa (notée inf 5kDa dans la suite) est directement reconcentrée sur ZipTipTM par le protocole robotisé et la fraction entre 5 et 10kDa (notée 5-10kDa dans la suite) est digérée de façon à générer des peptides plus petits et plus facilement ionisables et surtout d’éviter les profils du spectre de la Figure 16 où le signal est supprimé par des ions multichargés correspondant au même peptide. On peut vérifier que l’étape de fractionnement assure bien sa fonction en représentant l’élution du peptide 913.7Th sur le chromatogramme d’un échantillon avec ou sans fractionnement. On constate alors que ce peptide a totalement disparu de la fraction inf 5kDa. Ainsi d’autres peptides sont détectables en MS dans la même fenêtre de temps et donc éventuellement sélectionnables pour être fragmentés.

De l’intérêt de la digestion des fractions 5-10kDa et sup 10kDa

Protocoles de référence : Préparation des échantillons :  Recherche dans les banques et validation : V-A.6.1. a p.154, V-A.6.2. a p.155 Les fractions 5-10kDa et supérieure à 10kDa (notée sup 10kDa dans la suite) ont été digérées à la trypsine. Les peptides ainsi obtenus sont donc plus petits. D’autre part, cette digestion permet de placer un résidu basique en C-terminal des peptides ce qui permet à ces peptides d’être au minimum bichargés.

Ainsi la présence minimum d’une charge en N-terminal et en C-terminal implique une fragmentation plus régulière des peptides et donc une interprétation plus aisée des spectres. Dans ces fractions protéolysées, 848 peptides de 49 protéines différentes ont été identifiés avec un score moyen pour les spectres MS/MS de 52, ce qui là encore renforce la fiabilité des identifications (Tableau 4). Les recherches dans les bases de données en spécifiant no enzyme ont permis de mettre en évidence quelques peptides semi-tryptiques.

Cependant ils ne représentent que 20% des peptides totaux. D’autre part, ces peptides semi-tryptiques n’apportent généralement pas d’information supplémentaire sur les sites de clivages endogènes car leur extrémité non tryptique a déjà été identifiée dans la fraction inf 5kDa.