Recherche des enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN

Recherche des enzymes impliquées dans la voie de dégradation du 2-EHN

Les enzymes impliquées dans la voie de dégradation « partielle » du 2-EHN par M. austroafricanum IFP 2173 ont été recherchées par une approche protéomique. Nous avons identifié 35 protéines solubles spécifiques par électrophorèse bi-dimensionnnelle. L’identification des protéines induites a été confirmée par comparaison de gels 2DE colorés au bleu colloïdal et par un marquage métabolique au 35S. Les protéines membranaires (transmembranaires et associées à la membrane) ont été analysées sur gel SDS-PAGE, et comparées grâce à une identification exhaustive en LC-MS/MS. Nous avons comparé le degré d’expression des protéines sur la base de l’abondance relative calculée à partir d’indices de l’abondance de peptides, les « Spectral count » et les « emPAI ». Le résultat de l’analyse a montré que 300 protéines sont spécifiques au 2-EHN et que 65 sont plus abondantes sur 2- EHN et que les enzymes clés de la voie de dégradation des acides gras sont induites. Parmi ces enzymes figurent les enzymes de la β-oxydation, toutes retrouvées, lors de l’analyse protéomique des protéines solubles, sauf la thiolase qui catalyse la dernière étape du cycle. Plusieurs copies de ces enzymes ont été retrouvées au cours de l’analyse. Ceci permet d’une part de mettre en évidence la redondance de ces enzymes et d’autre part de montrer que la souche IFP 2173 est bien équipée pour dégrader les acides gras. Nous avons retrouvé plusieurs enzymes ayant une activité estérase et d’autres impliquées dans le métabolisme de l’azote. Ceci conforte les résultats qui ont montré que la bactérie utilise le 2-EHN comme unique source d’azote. Une protéine certainement impliquée dans la synthèse des acides mycoliques, « mycolic acid condensate », méritera que l’on s’attarde sur son mode d’action car elle est induite sur 2-EHN. Pour l’étape initiale de dégradation du 2-EHN, deux cytochromes P450 alcane 1-mono- oxygénase de type CYP153 ont été mis en évidence, l’un d’eux étant l’une des protéines induites les plus abondantes. Il s’agit du CYP153-1 qui a 99 % d’identité de séquence avec CYP153A de Mycobacterium sp. HXN-1500 (van Beilen et al. 2006). Toutes ces protéines pourraient intervenir dans la voie de dégradation du 2-EHN. Néanmoins, afin d’attribuer un rôle à chacune d’entre elles, il faut vérifier qu’elles interviennent effectivement dans la voie métabolique. Le clonage et l’expression de certaines enzymes a été entrepris et permettra à terme de connaître plus précisément leur activité catalytique et leur implication dans la dégradation du 2-EHN.

La plupart des protéines identifiées sont similaires à celles du génome de M. vanbaalenii PYR-1. Cette souche a été étudiée pour sa capacité à dégrader les HAP (Moody et al., 2005), et son génome a été séquencé en 2006 puis ré-annoté en avril 2008. Comme elle ne faisait pas partie du lot de souches dont j’ai testé la capacité à dégrader le 2-EHN au début de cette étude, j’ai refait des tests pour savoir si la souche PYR-1 dégradait le 2-EHN. Les résultats ont montré que même si elle possède un grand nombre d’enzymes en commun M. austroafricanum IFP 2173, elle ne dégrade pas le 2-EHN. En me basant sur des séquences du génome de la souche PYR-1, j’ai cloné deux gènes codant pour des alcane hydroxylases membranaires à partir du génome de IFP 2173. Les alcane hydroxylases de la souche IFP 2173 sont presque identiques à celles de la souche PYR-1. Quelques résultats d’analyse supplémentaires apportent des informations sur l’expression de ces enzymes, en rapport avec le métabolisme du 2-EHN : Des expériences de RT-PCR (amplification par PCR après traitement à la reverse transcriptase) ont montré que des gènes codant pour les alcane hydroxylases transmembranaire sont transcrits dans la souche IFP 2173 en croissance sur plusieurs substrats carbonés dont l’acétate et le 2-EHN. Curieusement, aucune des deux alcane hydroxylases membranaires n’a été détectée lors de l’analyse protéomique, suggérant qu’elles n’ont pas été séparées sur gel SDS ou bien qu’elles ont donné très peu de peptides identifiables par LC-MS. Le cytochrome P450 de type CYP153-1 est clairement induit sur 2-EHN, selon l’analyse protéomique. Ces résultats incitent à penser que c’est plutôt le CYP153 qui serait impliqué dans l’étape initiale d’oxydation du 2-EHN, mais nous ne pouvons pas exclure a priori la participation de l’une ou l’autre des alcane hydroxylases.