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Méthodes de dosage du glucose
Il existe une multitude de méthodes de dosage de la glycémie ; pour les besoins de notre étude nous n’exposerons que les principes de la méthode à l’hexokinase et de la méthode à la glucose-oxydase que nous avons utilisé. Ces 2 techniques représentent 99% des méthodes utilisées dans les laboratoires de biologie médicale (33).
Dosage de la glycémie par la méthode à l’hexokinase
Cette technique de dosage est basée sur la phosphorylation du glucose en présence de l’héxokinase en Glucose-6-phosphate. Ce dernier composé en présence de Glucose-6-phosphate déshydrogénase et de NAD entraîne la formation de 6-phospho-gluconolactone et de NADH, H+. Figure 3 : Mécanisme réactionnel du dosage du glucose par l’hexokinase (14)
La formation du NADPH, H+ entraîne une augmentation de l’absorbance à 340 nm qui est proportionnelle à la quantité de glucose initiale (14).
Dosage de la glycémie par la méthode à la glucose-oxydase
Elle est basée sur la réaction d’oxydation du glucose par la glucose oxydase en présence de O2, pour former du gluconolactone et du peroxyde d’hydrogène ; cette réaction est illustrée par la figure4.
Figure 4: Mécanisme réactionnel du dosage du glucose par la glucose-oxydase (33)
La détermination de la glycémie se fait par la détermination de la concentration de peroxyde d’hydrogène. Ce dernier est mesuré par l’intermédiaire d’une réaction faisant intervenir une peroxydase et un chromogène donneur d’hydrogène, pour aboutir à un composé coloré dont l’absorbance est mesurée par spectrophotométrie (14).
Outils de la comparaison de méthodes grâce au Multi-QC (2, 25)
Le MultiQC est un logiciel de traitement de données statistiques grâce auquel la comparaison des deux méthodes se fait par la détermination de deux types de graphiques :
– le diagramme de différences ;
– le diagramme de dispersion.
Le diagramme de différences
La différence des concentrations entre les deux fractions de chaque échantillon est reportée en ordonnée. La moyenne des deux fractions est reportée en abscisse. La discordance entre les méthodes est évaluée par l’écart entre les points et l’horizontale d’ordonnée nulle (ligne de différence nulle).
Le diagramme de dispersion
Les résultats de la nouvelle méthode sont reportés en ordonnée et ceux de l’ancienne en abscisse. Chaque échantillon est représenté par un point. La relation mathématique entre les méthodes est estimée par la droite de régression. La discordance entre les méthodes est évaluée par l’écart entre la droite de régression et la bissectrice des axes (la ligne d’identité) comme illustrée par la figure 5.
Figure 5 : Exemple de comparaison de méthodes avec un diagramme de dispersion à gauche et un diagramme de différences à droite (25)
Tolérance
L’erreur médicalement acceptable ou tolérance acceptée sur le produit s’exprime soit en valeur absolue (aux basses concentrations) ou en valeur relative (aux concentrations élevées).
Le logiciel MultiQC maintient une liste des tolérances pour chacun des analytes qu’il contrôle. Il permet de définir des schémas de tolérance avec une erreur relative (ou absolue) spécifique des trois zones de concentrations (basse, moyenne, haute).
– Le diagramme des différences
Pour chaque concentration en abscisse, la différence tolérable entre les méthodes est représentée par un segment vertical centré sur l’horizontale d’ordonnée nulle et l’ensemble de ces segments constitue un polygone symétrique par rapport à la ligne de différence nulle.
Figure 6: Exemple d’un polygone de tolérance du diagramme de différences (25)
Tout point se situant à l’intérieur du polygone satisfait à la commutabilité pour l’échantillon testé. Tout point extérieur au polygone traduit la non-commutabilité pour l’échantillon considéré. Le résultat final dépend du pourcentage de non-commutabilité sur l’ensemble du graphique.
– Le diagramme de dispersion
La construction d’un polygone de tolérance sur un diagramme de dispersion permet de délimiter les déviations acceptables de la droite de régression par rapport à la droite d’identité. Pour construire ce polygone, il faut d’abord considérer que l’erreur aléatoire soit assez faible pour la négliger par rapport à l’erreur de non-équivalence.
Figure 7 : Exemple d’un polygone de tolérance du diagramme de dispersion (25)
L’interprétation ne dépend pas de chaque point individuellement mais uniquement de la droite de régression. Tout segment de la droite intérieur au polygone satisfait au critère de commutabilité. MultiQC recherche quels points de la droite sont à l’intérieur du polygone de tolérance.
Le programme calcule d’abord les intersections entre la droite de régression et les contours supérieurs et inférieurs du polygone. Ces points constituent les extrémités des segments sous tolérance et leur projection sur l’axe des abscisses définit le domaine de commutabilité. Ce dernier peut associer plusieurs intervalles disjoints. Les méthodes sont commutables si le domaine de conformité est inclus dans le domaine de commutabilité.
TRAVAIL PERSONNEL
Méthodologie
Matériel
Objectifs de l’étude Objectif général :
Cette étude a consisté à comparer des résultats obtenus à partir de deux techniques de dosage de la glycémie : une, capillaire et l’autre veineuse. Les deux techniques utilisent la méthode enzymatique de la glucose oxydase.
Objectifs spécifiques :
Trois objectifs spécifiques ont été fixés:
– déterminer si les performances des ACCU-CHEK Active, dans le contexte de l’étude répondent aux standards internationaux tels que définis par EN ISO 15197 de 2003 ;
– déterminer la zone de commuabilité des deux méthodes de dosage ;
– déterminer des valeurs limites en dehors desquelles une confirmation au laboratoire est nécessaire.
Cadre d’étude
Ce travail a été effectué au niveau des agences d’une grande société de la place et du laboratoire de biochimie de l’université Cheikh Anta Diop de Dakar. La détermination de la glycémie capillaire a été effectuée au niveau des agences, alors que la glycémie veineuse a été déterminée au laboratoire de biochimie.
Durée de l’étude
Le recueil et le dosage des échantillons se sont déroulés du 07 Mai au 27 Juin 2012. L’analyse des données a eu lieu de février à mai 2013.
Ressources financières
Effectués dans le cadre d’un bilan systématique annuel, les coûts inhérents aux dosages ont été à la charge de la société demandeuse. Les couts d’exploitation des données ont été à la charge du laboratoire de biochimie.
Unité
Les résultats sont exprimés en grammes par litre (g/L) ou en milli-moles par litre (mmol /L), 1mmol/L = 0,18g/L.
Domaine de mesure (en unité)
Il correspond à l’étendue de la zone de linéarité de la technique de dosage par la méthode de la glucose-oxydase.
Pour le ACCU-CHEK il s’étend de 0,1 à 6 g/L soit 0,6 à 33,3 mmol/L.
Pour l’A 15 il s’étend de 0,0023 à 5 g/L soit 0,0126 à 27,5 mmol/L.
Valeurs usuelles (en unité)
Elles correspondent aux valeurs les plus souvent rencontrées avec les techniques les plus courantes chez les adultes sains.
Chez un sujet adulte avec un métabolisme normal, la glycémie à jeun est entre : 4,1- 5,9 mmol /l soit 0,74-1,06 g/L.
Sélection des échantillons et critères de non inclusion
Sur 1415 patients, 100 ont été choisis de façon arbitraire dans un souci de représentativité. Les résultats ont été sélectionnés de façon à avoir une représentation de 3 niveaux de concentrations (bas, moyen, élevé). La répartition doit être égale entre les sexes dans chaque niveau de concentration. Ont été exclus de l’étude les patients n’ayant pas respecté un jeûne d’au moins 8h.
Conditions pré-analytiques
La principale condition pré-analytique est le respect d’un jeûne d’au moins 8 heures. Le prélèvement veineux est effectué dans des tubes contenant du fluorure de sodium comme antiglycolytique et de l’héparinate de sodium comme anticoagulant.
Pour les prélèvements effectués à Dakar, les échantillons ont été conservés dans une glacière avec de la carboglace et acheminés vers le laboratoire toutes les trois heures.
Pour les prélèvements effectués en dehors du périmètre de Dakar, les échantillons ont été centrifugés, aliquotés et conservés au réfrigérateur puis placés dans une glacière avec de la carboglace au moment de l’acheminement vers le laboratoire.
Appareils d’analyses des échantillons
Le dosage de la glycémie veineuse a été effectué grâce à un automate A15 des laboratoires BioSystems®.
Le dosage de la glycémie capillaire a été effectué grâce à un glucomètre de type ACCU-CHEK Active des laboratoires Roche®.
Sérums de contrôle et calibrateurs
Pour l’automate A15 de BioSystems®, la calibration est effectuée lors de l’utilisation de chaque nouveau lot de réactif ou lorsque les contrôles passés jounalièrement sortent de l’intervalle indiqué par le fabriquant, et ceci à plusieurs reprises. Fourni par le fabriquant, le calibrateur est un sérum bovin lyophilisé qui contient plusieurs composants pour la calibration des paramètres mesurés.
Le contrôle est passé journalièrement avant toute analyse biochimique. Lorsque la valeur du contrôle est comprise dans l’intervalle indiqué par BioSystems® (0,704 -1, 06 g/L), cela permet de valider techniquement les résultats des spécimens des patients. Le contrôle utilisé est de niveau 1 c’est à dire un contrôle normal.
Pour le dosage de la glycémie capillaire (avec ACCU-CHEK Active) la calibration se fait grâce à une puce incluse dans chaque boîte de bandelettes. Chaque fois qu’une nouvelle boîte de bandelettes est entamée la calibration doit être effectuée.
Le contrôle doit être effectué à chaque ouverture d’une nouvelle boîte de bandelettes ou en cas de résultats douteux. Le contrôle existe sous 2 niveaux : un contrôle bas (2,1-3,7 mmol/L soit 0,37-0,67 g/L) et un contrôle normal (7,4-10 mmol/L ou 1,3-1,8 g/L).
Matériel de prélèvement
Lors du prélèvement, le matériel suivant a été utilisé:
– vaccutainer ;
– aiguille ;
– coton imbibé d’alcool 70° ;
– garrot ;
– tampon sec ;
– tubes sous vide avec anticoagulant et antiglycolytique ;
– centrifugeuse ;
– bandelettes ;
– vaccinostyle.
Méthodes
Prélèvement
Le prélèvement pour la glycémie veineuse est effectué après repérage et décontamination de la zone à prélever à l’aide d’un coton imbibé d’alcool 70°. La ponction est ensuite effectuée grâce à une aiguille adaptée sur un vaccutainer, et le recueil se fait avec des tubes sous vide contenant un antiglycolytique et un anticoagulant.
Pour la glycémie capillaire : le bout du doigt est décontaminé à l’aide un coton imbibé d’alcool. La piqure se fait grâce à un vaccinostyle, la première goutte de sang est éliminée puis la deuxième est recueillie.
Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES
I. Rappels sur métabolisme glucidique et sa régulation
I.1. Métabolisme glucidique
I. 2. Régulation
I.2.1. Facteurs métaboliques
I.2.2. Facteurs hormonaux
I.2.3. Facteurs nerveux
II. Méthodes de dosage du glucose
II.1. Dosage de la glycémie par la méthode à l’hexokinase
II.2. Dosage de la glycémie par la méthode à la glucose-oxydase
III. Outils de la comparaison de méthodes grâce au Multi-QC
III.1. Le diagramme de différences
III.2. Le diagramme de dispersion
III.3. Tolérance
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL PERSONNEL
I. Méthodologie
I.1. Matériel
I.1.1. Objectifs de l’étude
I.1.2. Cadre d’étude
I.1.3. Durée de l’étude
I.1.4. Ressources financières
I.1.5. Unité
I.1.6. Domaine de mesure
I.1.7.Valeurs usuelles
I.1.8. Sélection des échantillons et critères de non inclusion
I.1.9. Conditions pré-analytiques
I.1.10. Appareils d’analyses des échantillons
I.1.11. Sérums de contrôle et calibrateurs
I.1.12. Matériel de prélèvement
I.2. Méthodes
I.2.1. Prélèvement
I.2.2. Détermination de la valeur de la glycémie
I.2.3. Niveaux de concentration et répartition des spécimens de patients
I.2.4. Critères de comparaison
I.2.5. Analyse des données et exploitation des résultats
II. Résultats
II.1. Résultats descriptifs
II.1.1. Répartitions des spécimens et niveaux de concentrations
II.1.2. Répartition des spécimens en fonctions du sexe
II.1.3. Moyennes des glycémies
II.2. Résultats analytiques, analyse du MultiQC
II.2.1. Diagramme de dispersion
II.2.2. Diagramme de différences
II.3. Représentation des résultats selon les normes de 15197 de 2003
III. Discussion
CONCLUSION
Références bibliographiques
