Protocole fabrication de vésicules unilamellaires géantes (GUVs)

Protocole fabrication de vésicules unilamellaires géantes (GUVs)

Protocoles bactériophage T5 

Mise en place d’un assay in vitro d’éjection de l’ADN de T5 en virus unique

Principe Le principe général de ces expériences est de suivre le processus d’éjection de l’ADN du phage à l’échelle du virus unique. Les phages sont d’abord incubés en présence de FhuA puis immobilisés sur une surface. Pour révéler l’éjection de l’ADN, une molécule fluorescente marquant l’ADN est ajoutée dans le buffer. La capside du phage est imperméable aux molécules utilisées, ce qui permet de ne marquer que l’ADN qui est à l’extérieur du phage. (voir figure 15.1) Ces expériences sont réalisées en cellule de flux, ce qui permet : – de changer facilement et rapidement de buffer – d’étirer la molécule d’ADN au fur et à mesure de son éjection.

Montage expérimental

Une cellule de flux (ibidi µ-Slide VI 0.4) est placée sur le plateau d’un microscope inversé (Zeiss Axioplan 200) équipé d’une caméra EMCCD (Andor iXon) et d’un dispositif de visualisation de fluorescence. L’objectif de microscope est un Zeiss 40x d’ouverture numérique 1.2. Un pousse-seringue (WPI) est utilisé afin de contrôler le flux de solution dans la chambre de flux. La caméra Andor a un capteur de 512*512 pixels, d’une dimension de 16µm ∗ 16µm. Au 40x, un champ d’observation correspond donc à un coté de 200µm.

Mesure de la longueur d’ADN éjectée

Lorsque les éjections d’ADN sont réalisées sous flux, une force de cisaillement est exercée sur l’ADN qui s’allonge dans le flux. Il est possible d’extraire la longueur d’ADN étendue dans 15.1 Mise en place d’un assay in vitro d’éjection de l’ADN de T5 en virus unique157 ThuA Phage A B C D E F Figure 15.1 – Principe des expériences en virus unique le flux en fonction du temps. Pour ce travail un peu fastidieux, un plugin a été écrit sur le logiciel ImageJ qui permet d’effectuer une mesure semi automatique de la longueur éjectée en fonction du temps. Le fond fluorescent est soustrait pour chaque image à partir de la moyenne de l’intensité de l’image. En effet, les molécules d’ADN étant assez dispersées sur chaque image, la fluorescence moyenne de l’image est peu éloignée du fond réel. Le plugin permet, à partir d’un segment grossièrement défini par l’utilisateur sur la molécule d’ADN, d’optimiser localement la position du segment afin de maximiser son rapport signal/bruit. Le signal de fluorescence d’un segment est égal à l’intensité intégrée de long de ce segment. Le bruit est proportionnel à la racine de la longueur du segment. Le segment optimal est trouvé en cherchant le segment ayant le meilleur rapport d’intensité intégrée sur la racine de la longueur du segment. Calibration de l’étirement de l’ADN en cellule de flux La longueur apparente de l’ADN a été mesurée en fonction du taux de cisaillement appliqué dans la chambre de flux et en fonction de la longueur de l’ADN. La dépendance de l’allongement des molécules d’ADN dans les chambres de flux est complexe [85]. Il n’y a pas de loi facilement applicable pour retrouver la longueur de la molécule d’ADN en kbp en fonction de la longueur apparente. C’est pourquoi la méthode la plus judicieuse pour y remonter est de mesurer l’étirement de molécules de longueur connues pour ensuite pouvoir inverser cette relation. Voir figure 15.2, pour les courbes de calibration.

 Mesure de la quantité d’ADN éjectée par intégration de fluorescence

Une autre méthode permettant de mesurer la cinétique d’éjection consiste à mesurer l’augmentation de fluorescence liée à l’éjection de l’ADN. Dans cette méthode la fluorescence intégrée est mesurée au cours du temps sur un rectangle entourant la molécule d’ADN apparente. Le fond fluorescent est soustrait en mesurant la fluorescence moyenne sur un carré proche de l’éjection. La courbe est alors normée en divisant l’intensité de fluorescence par la fluorescence finale. 1 De plus afin de réduire le bruit, l’intensité de fluorescence est intégrée sur 3 surfaces de taille croissante au fur et à mesure que l’ADN s’étend. La résolution est donc meilleure au début de l’éjection qu’à la fin, ce qui explique l’augmentation du bruit au cours de l’éjection (voir figures 10.2, par exemple). Le détail du traitement sur un exemple est montré figure 15.3. 

Comparaison des deux méthodes

Théoriquement, la méthode par mesure de longueur est limitée par la résolution optique. 500nm représentant environ 1,5kb d’ADN étiré, il s’agit de la résolution maximale. En pratique plusieurs problèmes se présentent : – les fluctuations limitent fortement cette résolution. L’ADN fluctue beaucoup lorsqu’il est étiré. Ces fluctuations sont d’origine thermique mais elles sont aussi dues aux fluctuations du débit de tampon. Pour limiter ces fluctuations, il faudrait imposer un débit plus fort, ce qui réduirait les fluctuations thermiques et les fluctuations liées au débit. Cela demanderait néanmoins une quantité importante de buffer, et de plus, la force exercée par le flux viendrait peut être modifier la cinétique d’éjection. – De plus, lorsque peu d’ADN est éjecté, il est très difficile de l’étendre, car la force exercée sur l’ADN dépend de la longueur de la molécule. Etant peu étiré, la résolution est mauvaise pour le début de l’éjection. – Enfin, la présence d’éjections “en boucle” (voir section 10.5) réduit encore la résolution de la méthode. – Enfin, lorsque l’on compare les courbes obtenues avec les 2 méthodes, on voit distinctement qu’il existe un retard de cette méthode par rapport à l’autre (voir figure 10.9 pour un exemple). En effet, l’ADN est éjecté beaucoup plus rapidement qu’il n’est étendu par le flux. La méthode par intégration de fluorescence supprime nombre de ces inconvénients : elle est peu sensible aux fluctuations de la molécule. Il reste néanmoins nécessaire que l’ADN reste dans le plan focal d’observation, ce qui est réalisé si la molécule est étirée sous flux. La résolution optique ne limite pas la résolution en terme de quantité d’ADN. Le bruit dépend de la surface d’intégration. La résolution est donc meilleure lors de l’initiation de l’éjection, puis diminue petit à petit. L’éjection en boucle est un avantage pour cette méthode puisque la surface d’intégration est réduite, ce qui diminue le bruit. Néanmoins, la méthode par mesure de longueur n’est pas dénuée d’intérêt. Elle a permis de vérifier l’éjection en boucle. C’est de plus une méthode pour contrôler le fait que lorsque l’intensité ne varie plus, c’est que tout l’ADN a été éjecté. Enfin on peut vérifier que le mutant T5amHA911 a un ADN 8% plus grand que T5st(0).