Protocole d’extraction et de purification d’ADN

Protocole d’extraction et de purification d’ADN

Pour chaque ver, 25 mg de tissus (trois ou quatre proglottis) sont prélevés et placés dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Ces tissus sont préalablement sectionnés et dissociés en plusieurs petits morceaux pour une lyse optimale. Puis 180 μl du Tampon ATL et 20 μl de Protéinase K sont ajoutés et vortexés rigoureusement avant d’être incuber à 56°C: en utilisant une étuve minus d’une plateforme Rotor incorporée. Cette phase d’incubation dure en moyenne 3 h mais il est recommandé de la laisser toute une nuit pour une lyse complète. Après incubation le lysat est vortexé pendant 15 s. En suite 200 μl du Tampon AL et 200 μl d’Ethanol (96-100%) sont successivement ajoutés tout en vortexant pour bien mixer. Le mélange obtenu est transféré sur une colonne (Mini Spin Column) minus d’un tube collecteur de 2 ml, puis centrifugée à 8000 tour/mn pendant 1 mn. Cette étape permet de retenir l’ADN au niveau de la membrane de la colonne (ADN chargé négativement se fixe, par interactions ioniques, sur la membrane de silice chargée positivement). Par contre les protéines, les lipides et les polysaccharides sont éliminés au niveau du tube de collection de 2 ml. La colonne est placée dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et 500 μl du Tampon AW1 sont ajoutés puis elle est centrifugée à 8000 tour/mn pendant 1 mn. Cette même colonne est ensuite placée dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et 500 μl du Tampon AW2 sont ajoutés, elle est centrifugée cette fois à 14000 tour/mn pendant 3 mn. Ces deux lavages successifs permettent d’enlever les contaminants et les volumes résiduels d’éthanol pouvant interférer avec les réactions PCR. La colonne est en fin placée dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml et 200 μl du Tampon AE sont ajoutés. Ce tube est incubé pendant 1 à 2 mn à la température ambiante puis élué en centrifugeant à 8000 tour/mn pendant 1 mn. La visualisation de l’extrait d’ADN se fait par électrophorèse sur gel d’agarose 1,5 %

Les expériences de PCR et de Séquençage

Matériels de PCR et de Séquençage

Pour la PCR et le séquençage nous avons utilisé comme matériel: Perkin Elmer PCR, Pipettes, Tubes PCR, Cônes PCR, DNTP 0,2 mM each, MgCl2 2,0 mM, Tampon 1X (Takara), Ex Taq Hot Start Version (TaKaRa), Set d’amorces des différents gènes (COI, ITS1 et 18S), Illustra ExoStar (GE Healthcare), BigDyeTM Terminator v3.1, 3500 DNA Sequencer (Life Technologies) 

2. Protocole de PCR et de Séquençage

Le même mix réactionnel PCR est utilisé pour les trois gènes (gène mitochondrial Cytochrome C Oxydase 1 COI, gènes nucléaires Internal Transcribed Spacer 1 ITS1 et la petite sous unites de l’ADNr 18S). Les amorces de chaque gène sont obtenues à l’aide du logiciel Genalys. Il s’agit pour le gène COI, les amorces sens MoCOIF5’CTGAGTGTTTT CAAAACATTTAG-3’ et anti-sens MoCOIR5’-AAGCATGATGCAAAAGGCA-3’, pour l’ITS1, les amorces sens ITS1-F 5’-GCTGTACCCGCATGATGTT-3’ et anti-sens ITS1-R5’-GGCAAGCCTAGCCGCAAT-3’ et ITS1-R15’-AGCAATAGTGCTTTAACGC GC-3’ et la 18S les amorces sens 18SF (5’-TCCTGCCAGTAGTCAT ATGC-3’) et anti-sens 18SR (5’CTTGTTACGACTTTTACTT CCTCT-3’). Le mix réactionnel de 20 μl est composé de: 0,3 µl d’ExTaq Hot Start Takara (5 μ/μl), 2 µl de dNTP (0,2 mM), 1,5 µl de tampon 1X, 1,5 µl de (MgCL2 2 mM) PCR, 1 µl d’amorce (1 pmol), 1 μl d’ADN (50 ng/μl) et 12,7 µl H20. Le cycle d’amplification est le suivant: 35 cycles de 30 s à 94 °C, 30 s à 55°C and 45 s à 72°C. Les produits PCR sont ensuite purifiés par traitement à l’Illustra ExoStar (GE Healthcare) pour éliminer les excès de dNTPs et d’amorces. Les produits purifiés sont directement séquencés avec le BigDyeTMTerminator V3.1 en utilisant le séquenceur 3500DNA Sequencer (Life Technologies). Brièvement chaque réaction de séquence contient 1 μl de produit PCR, 1 μl de BigDye, et 3 μl d’eau, soit un volume réactionnel de 5 μl. Le programme de Séquençage est de 20 cycles de 4mn à 94°C et 30 s à 60°C. Les produits de Séquence sont ensuite purifiés à la Séphadex G50 hyperfine.

 Analyse génétique

Les séquences obtenues sont corrigées et alignées par GenalysV3.3 et ClustalW2.0 (Thompson et al., 1994). L’alignement permet de mettre en évidence l’homologie ou les mutations entre les séquences des différents individus. Les arbres phylogénétiques sont construits avec le logiciel MEGA version 5, par la méthode du Neighbor-Joining avec le model de Kimura (2-parameter) (Tamura et al., 2007). La robustesse des branches a été évaluée pour 1000 répétitions de Bootstrap. Les cestodes Cyclophyllidea Echinococcus oligarthrus et Dipylidium caninum ont été utilisés pour enraciner les arbres car les recherches Blast dans les bases de données ont montré qu’ils sont proches des Moniezia. 

Description des Anoplocephalidae rencontrés

Les cestodes sont prélevés dans l’intestin grêle des petits ruminants. L’utilisation de la microscopie photonique a permis d’identifier quatre genres: Moniezia, Avitellina, Stilesia et Thysaniezia. Les spécimens de chaque genre ont été ensuite étalés et colorés au niveau de leurs anneaux matures ou gravides. Moniezia spp. (Figure 4) Le scolex porte 4 ventouses saillantes. Les segments sont beaucoup plus larges que longs. Après coloration nous avons observé sur les segments mûrs: deux ovaires en forme de fer à cheval, deux glandes vitéllogènes, de nombreux testicules, deux pores génitaux, une rangée de glandes interproglottidiennes globuleuses sur le bord postérieur de chaque segment. Avitellina spp. (Figure 5). Le cou est large, scolex volumineux et porte 4 ventouses saillantes. La segmentation externe est peu visible. Les pores génitaux sont irrégulièrement alternés. Les testicules sont nombreux et dispersés. Les utérus sont disposés transversalement au milieu des proglottis. La portion ovigère est cylindrique et renferme un seul organe parutérin. Stilesia spp. (Figure 6) Le scolex porte 4 ventouses. Ces vers ont une segmentation externe peu visible et ils sont frisés. Les pores génitaux sont irrégulièrement alternés. Chaque segment ovigère renferme deux organes parutérins. Thysaniezia spp. (Figure 7) Le scolex porte 4 ventouses. Les segments mûrs renferment des pores génitaux irrégulièrement alternes. Chaque segment ovigère renferme de très nombreux organes parutérins.