BNGR-HASS
Protéolyse aspécifique et fragmentations stepped-HCD pour la comparaison de deux hCG d’origines géographiques distinctes
Protocole de glycoprotéomique bottom-up et identification
Préparation de l’échantillon
Les échantillons de protéine ont été dilués à un rapport volumique 1 : 1 dans une solution de Bicarbonate d’Ammonium (ABC) concentrée à 50mM (pH 7,8). La dénaturation des protéines a été effectuée en suivant un protocole classiquement employé au laboratoire. La réduction des ponts disulfures a été effectuée en solution par l’ajout de dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 10 mM (à partir d’une solution stock concentrée 10X).
La solution a été incubée à 56°C pendant 35 minutes sous agitation modérée. Après retour à température ambiante, les échantillons ont été traités avec de l’iodoacétamide (IAM) à une concentration finale de 50 mM (à partir d’une solution stock 10X) afin d’alkyler les cystéines libres et bloquer leur réactivité. Cette réaction s’est déroulée à température ambiante pendant 30 minutes, à l’obscurité pour éviter la destruction du réactif IAM.
Les protéines sont digérées soit par un mélange LysC-Trypsine, ou par la pronase, ou par les deux. Dans les faits, la trypsine hydrolyse la liaison peptidique en position C-terminale des lysines, comme la LysC, le mélange des deux enzymes ne modifie pas les sites de protéolyse mais permet de diminuer le nombre de missed-cleavages. Une masse de 0,2 µg de LysC-Trypsine a été utilisée pour chaque digestion, avec une incubation d’environ 18 heures à 37°C sous agitation modérée.
Les digestions à la pronase ont été faites dans les mêmes conditions avec une quantité d’enzyme de 10 µg. La double digestion LysC-Trypsine/Pronase a consisté à digérer les échantillons d’abord par la LysC-Trypsine puis par la pronase, dans les conditions énoncées précédemment.
Analyse LC-MS/MS
L’analyse des (glyco)peptides produits par les différents protocoles de protéolyse a été effectuée par une approche classique de protéomique bottom up en LC-MS/MS. ~ 128 ~ Le système de chromatographie liquide utilisé est un appareil de nanoLC RSLCnano UltiMate 3000 de la société ThermoFisher Scientific. La miniaturisation permet l’utilisation de source nano-électrospray et un gain important en sensibilité par rapport à la LC-ESI conventionnelle.
Une pré colonne de type C18 a été utilisée (Acclaim PepMap100, diamètre interne 300 µm x 5 mm, taille de particule 5 µm, ThermoFisher Scientific). La colonne analytique utilisée est une colonne capillaire de phase C18 (Acclaim PepMap100 C18, diamètre interne 75 µm x 50 cm, taille de particule 3 µm, porosité 100 Å, ThermoFisher Scientific). Les différentes phases mobiles sont les suivantes : phase A (98% H2O, 2% ACN, 0.05% FA), phase A’’ (98% H2O, 2% ACN, 0.1% FA), phase B (90% ACN, 10% H2O, 0.1% FA).
Un montage pré colonne/colonne a été utilisé, permettant la préconcentration des échantillons dans un volume inférieur au volume total de la colonne analytique (2,2 µL environ). Les échantillons ont été injectés en triplicats dans un volume de 2 µL, dans une boucle de 20 µL. Ils sont ensuite chargés sur la pré-colonne C18 dans une phase mobile composée à 100% de A’’, à un débit de 15 µL/min.
La rotation de la valve portant la pré-colonne, 5 minutes après l’injection, permet la mise de cette dernière « en ligne » avec la colonne analytique (dans le même flux de phase mobile). Initialement composée d’un mélange de phase A (99%) et de phase B (1%), la composition de la phase mobile augmente de façon linéaire à 40% de phase B en 60 minutes.
La proportion de phase B est ensuite rapidement portée à 90% et maintenue pendant 15 minutes afin d’éluer les molécules fortement retenues (flush), puis la composition de la phase mobile est ramenée à son état initial (1%B) et équilibrée pendant une durée de 30 minutes. Ce gradient permet une séparation dans le temps des peptides en fonction de leur hydrophobie, principalement. La séparation a été faite à un débit constant de 300 nL/min.
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