PROPRIETES FLUORESCENTES ET PHOTOCHIMIQUES DE METABOLITES ISOLES A PARTIR DE HARALDIOPHYLLUM

INTRODUCTION GENERALE 

Les métabolites secondaires forment une famille de composés extrêmement variés sur le plan structural avec des milliers de molécules d’origine marine ou terrestre isolés et incorporant plusieurs centaines de squelettes carbonés. Ils ont un rôle essentiellement écologique. La synthèse et le stockage de ces molécules au sein des organismes marins ou des plantes terrestres sont une réponse chimique aux multiples interactions liées à la survie des espèces. L’implication des métabolites secondaires au niveau de ces interactions entre l’organisme et le biotope est souvent due à leur forte activité contre les agents pathogènes, ou leur toxicité contre les prédateurs [1-3]. Cette activité biologique est à l’origine de l’extraordinaire développement de la chimie des produits naturels et celle d’origine marine en particulier. En effet, l’étude de ces produits naturels a conduit à l’isolement et à l’identification de plusieurs molécules possédant une activité thérapeutique notable. Parmi une multitude d’exemples, on peut citer le cas du célèbre antipaludique, l’artémisinine qui est une lactone sesquiterpénique endoperoxydique isolé d’une plante chinoise (Artemisia annua). A partir d’une algue rouge des côtes Sénégalaises, ont été isolées de nouvelles classes d’alcaloïdes indoliques, almazole C et almazole D (schéma 1) qui présentent aussi une forte fluorescence [4,5]. L’almazole D possède en plus une forte activité antibactérienne [5]. Dans le cadre du présent travail, nous avons aussi isolé et identifié à partir d’un échantillon de Guiera senegalensis du Sénégal, le 5-méthylflavasperone très fluorescent, qui est un naphtopyranone déjà isolé d’une collection de Guiera senegalensis récolté en Guinée Bissau.[6,7]. N H O N NMe2 H almazole C N H O N NMe2 H C O OH almazole D OCH3 O H3CO OCH3 H H H CH3 H O Naphtopyranne Schéma 1 2 Pour les almazoles C et D, la fluorescence est probablement due à la présence du noyau indolique alors que pour le naphtopyranone, elle est liée à la présence du cycle naphtalène lié au cycle pyranone. Notre objectif est d’étudier les propriétés photochimiques de ces métabolites secondaires, bioactifs et très fluorescents, car ces propriétés constituent la ‘’carte d’identité’’ de chaque molécule. Le choix porté sur ce thème est d’autant plus pertinent que ni les almazoles C et D, ni le naphtopyranone n’ont fait l’objet d’étude de propriétés fluorescentes. Par ailleurs, l’activité antibactérienne de l’almazole D peut motiver une étude des propriétés photochimiques pouvant permettre de suivre en cas d’usage pharmacologique, la molécule ou ses dérivés présents dans les liquides physiologiques (urine, sérum, etc.). L’étude des propriétés fluorescentes portera sur les almazoles C et D isolés à partir de Haraldiophyllum sp qui est une algue rouge des côtes Sénégalaises, et sur un naphtopyranone isolé de Guiera senegalensis. Cette thèse sera structurée en quatre parties :  Dans la première partie, nous présentons les généralités sur le matériel et les techniques d’extraction, de chromatographie et de spectroscopie mises en œuvre.  La deuxième partie sera consacrée à l’étude des propriétés fluorescentes et photochimiques des almazoles C et D, puis à l’optimisation des conditions analytiques en étudiant l’effet du pH puis celui du solvant. La stabilité des molécules vis-à-vis de la lumière sera aussi étudiée en les irradiant par la lumière UV.  Dans la troisième partie, nous allons étudier les propriétés fluorescentes et photochimiques d’un naphtopyranone et par la suite optimiser les conditions analytiques.  La quatrième partie fera l’objet de l’isolement et l’étude structurale de biomolécules isolées d’une gorgone, Eunicella Labiata de la cote Sénégalaise.

CARACTERISTIQUES TECHNIQUES DU MATERIEL UTILISE

  La chromatographie sur couche mince (CCM) a été réalisée sur des plaques de verre couvertes d’une couche de silice, prête à l’emploi (Si 60 F254 (0,25mm)) ; RP18 (0,25mm) ; CN (0,25mm). Ces plaques sont obtenues chez « Merck ».  La « flash » chromatographie (FC) a été réalisée en phase normale sur gel de silice (Si 60, 15-25 µm) et en phase inverse sur de petites colonnes lichrolut RP-18 ou sur lichroprep RP-18, 15-25µm (Mereck).  La chromatographie sur colonne a été réalisée sur gel de silice (Si 60, 63-200 µm).  La chromatographie liquide haute performance (HPLC) a été effectuée sur un Hitachi L 6200 « Intelligent Pump » muni d’un détecteur L 300 photo diode. Nous avons utilisé selon le cas des colonnes Si 60, RP-18, ou CN. Le débit a été fixé à 5 ml / mn alors que le spectrophotomètre UV a été réglé à 215, 225, ou 254 nm.  Toutes les évaporations ont été effectuées sous pression réduite et à une température ne dépassant pas 50° C.  Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre VARIAN XL-300 (299,94 MHz pour le proton et 75,45 MHz pour le carbone) et sur un BRUCKER de 400 MHz (400MHz pour le proton et 100 MHz pour le carbone). Les déplacements chimiques (δ) sont indiqués en ppm relativement au tétraméthylsilane comme référence interne (0,0 ppm) et au solvant : CDCl3 [δ (H) 7,25 ; δ (C) 77] ; (CD3)2SO [δ (H) 2,5 ; δ (C) 39,5] ; C6D6 [δ (H) 7,15 ; δ (C) 128]. Les constantes de couplage en Hz sont déterminées par des expériences de découplage de spins. Les multiplicités en RMN du Carbone 13 ont été établies dans chaque cas à l’aide d’un DEPT.  Les spectres de masse par impact électronique ont été enregistrés sur un spectromètre KRATOS MS 80. Les spectres de masse par ESI ont été enregistrés avec un spectromètre Bruker Esquire-LC équipé d’une source d’ionisation par électro nébulisation. 5  Les spectres d’émission et d’excitation ont été obtenus à l’aide d’un spectrofluorométre Kontron, modèle SFM-25 (Zurich, Suisse) relié à un ordinateur et piloté, par le logiciel LCWIN. Une cuve parallélépipédique en quartz ( Labo moderne France) comprenant cinq faces polies (trajet optique, 1cm) a été utilisée pour les mesures.  Le systéme d’irradiation est composé d’une lampe à haute pression de mercure, Osram 200Watts HBO avec une alimentation Oriel modèle 8500. Ce dispositif photochimique inclut une lampe et une lentille de quartz appropriées pour concentrer les radiations sur la cuve contenant la solution placée à 60cm de la lampe au mercure.  Les mesures de pH ont été effectuées avec un pH-métre Consort modèle pro7.  Des micropipettes pipetman de 5 à 1000µL (Gibson, France) ont été utilisées pour le prélèvement des échantillons à diluer. Les mesures expérimentales ont été traitées avec un logiciel spécialisé : Microcal Origine, version 6.0, qui permet également de tracer les courbes. 

TECHNIQUES D’EXTRACTION ET D’ISOLEMENT 

Selon l’état physique des milieux entre lesquels l’échange de soluté se fait, on peut distinguer trois modes d’extraction : l’extraction solide-liquide, liquide-liquide et l’extraction par un fluide supercritique. 

 EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE

 L’extraction liquide-liquide est une opération qui permet la séparation d’un ou plusieurs constituants par l’utilisation de leur distribution inégale dans deux liquides généralement non-miscibles. Elle est réalisée par le contact intime du solvant avec la solution contenant les constituants à séparer (solutés) dans des appareils destinés à mélanger les deux phases comme l’ampoule à décanter. Le solvant extrait sélectivement un ou plusieurs des solutés pour conduire à un mélange appelé extrait. La phase résiduelle épuisée en solutés est appelée raffinat. 6 L’utilisation d’un procédé liquide-liquide requiert deux opérations successives : – Une mise en contact intime des deux liquides durant un temps suffisant à l’obtention de l’équilibre pendant lequel le ou les solutés sont transférés dans le solvant d’extraction. Il faut noter qu’à l’équilibre, le rapport des concentrations du soluté dans l’extrait et le raffinat, appelé coefficient de partage ou de distribution, donne une mesure de l’affinité relative du soluté pour les deux phases. – Après leur contact, on procède à la séparation des deux phases (extrait et raffinat). L’extraction liquide-liquide est une méthode de choix pour la séparation de liquide lorsque la distillation ou la cristallisation ne sont pas possibles ou trop difficiles. Pour améliorer l’efficacité de l’extraction, il est préférable d’effectuer plusieurs extractions en série avec de petites portions de solvant d’extraction, plutôt que d’effectuer une seule extraction avec un grand volume. 

EXTRACTION SOLIDE-LIQUIDE 

L’extraction solide-liquide est une opération qui permet d’extraire un ou plusieurs constituants d’un échantillon souvent mis sous forme de poudre pour faciliter l’opération. Parmi les principales méthodes d’extraction solide-liquide, on distingue la macération, la décoction, l’infusion et l’extraction au soxhlet. – La macération : C’est un procédé qui consiste à laisser séjourner pendant un temps suffisamment long un solide dans un liquide pour en extraire les composés solubles. C’est une méthode qui peut se faire de manière continue, le solvant pouvant être renouvelé plusieurs fois. Elle est souvent utilisée pour les composés sensibles à la chaleur. – La décoction : C’est une méthode d’extraction des principes actifs ou des arômes d’un échantillon végétal placé dans l’eau bouillante. Il faut donc que ces substances ne soient pas thermolabiles. 7 – L’infusion : C’est une méthode d’extraction des principes actifs ou des arômes d’un échantillon végétal placé dans l’eau bouillante qu’on laisse refroidir aussitôt. – L’extraction au soxhlet : C’est un procédé mixte dans lequel l’échantillon à extraire, placé dans une cartouche poreuse, est macéré dans l’extracteur E, alors que la solution est chauffée à ébullition dans le ballon B. Sous l’effet de l’ébullition, les vapeurs de solvant montent dans le tube à vapeur de E et arrivent au réfrigérant R ou elles se condensent pour tomber ensuite dans la cartouche placée dans l’extracteur E. Une fois l’extracteur rempli de solvant, le trop plein, par effet de capillarité, provoque un siphonage qui envoie le solvant dans le ballon et le cycle recommence. Ce procédé permet une économie du solvant. Par contre, il ne convient pas aux composés thermolabile.