PRINCIPES TOXIQUES DE FEUILLES DE
Gambeya boiviniana
Traitement par le n-butanol
Principe
C’est une technique d’extraction liquide-liquide basée sur le transfert d’un ou de plusieurs constituant(s) d’une phase liquide (phase aqueuse) vers une autre phase liquide extractive (phase butanolique) qui est non miscible à la précédente.
Mode opératoire
L’extrait à traiter est mélangé volume à volume au n-butanol dans une ampoule à décanter. Le mélange est agité fortement, puis laissé reposer jusqu’à décantation totale aboutissant à la formation de deux phases nettes : une phase supérieure butanolique ou phase organique et une phase inférieure aqueuse. Les deux phases sont récupérées séparément. La phase aqueuse est soumise de nouveau à trois autres fractionnements successifs. Les quatre phases butanoliques ainsi obtenues sont rassemblées puis filtrées sur papier filtre pour éliminer les gouttelettes d’eau de saturation. Un grand volume d’eau distillée est ajouté au filtrat puis le butanol est évaporé. La phase aqueuse est débarrassée des traces de butanol par évaporation après addition d’eau distillée.
Précipitation par l’acétate neutre du plomb (ANP)
Principe
L’ANP, comme la plupart des sels de métaux lourds, permet la défécation d’extraits biologiques en précipitant les grosses molécules telles que les protéines, les acides nucléiques, les polysaccharides ainsi que d’autres substances comme les acides organiques.
Mode opératoire
Une solution aqueuse d’ANP à 20% (p/v), de volume déterminé, est ajoutée goutte à goutte dans l’extrait à purifier soumis à une agitation magnétique. Le précipité formé est éliminé par centrifugation à 3000trs/min pendant 10min. L’addition d’un volume déterminé d’une solution aqueuse de phosphate disodique à 10% (p/v) permet d’éliminer l’excès de plomb dans le surnageant. Une autre centrifugation à 3000trs/min pendant 10min est réalisée afin d’écarter le précipité formé. Le surnageant est récupéré.
Chromatographie sur gel SEPHADEX.
Principe
C’est un procédé permettant la séparation des substances suivant leur taille et leur forme moléculaire. Le Sephadex est un gel préparé par réticulation d’un polymère anhydroglucosé : le dextrane. Il joue un rôle de tamis moléculaire. Les grosses molécules ayant un poids moléculaire élevé ne pénètrent pas dans les pores du gel. Elles restent dans le liquide extragranulaire et sortent les premières dans le volume mort de la colonne. Elles sont dites exclues. Par contre, les petites molécules diffusent facilement dans les pores du gel et leur élution se fait lentement le long de la colonne. Les molécules sont alors éluées par ordre des poids moléculaires décroissants.
Mode opératoire
Préparation du gel
Le gel est mis à gonfler pendant 3h à la température ambiante dans l’eau distillée, puis dégazé sous pression réduite au moyen d’une pompe à vide. La suspension est coulée dans une colonne de verre de dimensions déterminées. La surface supérieure du gel est 10 Etude chimique stabilisée avec un disque de papier filtre. La colonne est ensuite équilibrée par percolation de trois fois son volume de solvant de chromatographie (eau distillée).
Dépôt de l’échantillon et élution
Après équilibrage, l’échantillon est déposé avec précaution à la surface du gel. Les différentes substances sont ensuite éluées par lavage par gravité à l’eau distillée. Les fractions sont récoltées à volume constant au moyen d’un collecteur de fractions LKB. Un entretien particulier du Sephadex n’est pas nécessaire après son utilisation. La colonne est immédiatement prête à un autre emploi après lavage avec un grand volume d’eau distillée. En vue de sa conservation, elle est lavée avec une solution d’azide de sodium à 2% pour prévenir toute altération d’origine microbienne.
Dialyse
Principe
La dialyse est une technique de séparation des substances, utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane appelée membrane de dialyse qui est constituée de cellophane sous forme de cylindre allongé appelé boudin ou sac à dialyse. Grâce à la perméabilité sélective de la membrane, les grosses molécules peuvent être séparées des petites molécules par un phénomène d’osmose et de diffusion. La membrane sépare ainsi deux solutions de concentrations différentes : le liquide à dialyser et le liquide contre lequel s’effectue la dialyse. Les solutés diffusent de la solution la plus concentrée vers la plus diluée. Le phénomène s’achève dès que l’équilibre de concentration entre les deux solutions est atteint. La vitesse de la dialyse est influencée par la température, le rapport entre la surface de la membrane et le volume de la solution à dialyser, le diamètre des pores de la membrane, le temps de contact, la différence de concentration entre les deux milieux.
Mode opératoire
La membrane de dialyse contient de la glycérine, des composés sulfurés et des métaux lourds qu’il faut préalablement éliminer. Pour ce faire, elle est mise à bouillir dans de l’eau distillée pendant 15min. L’eau est ensuite changée et l’opération est répétée trois fois. La membrane ainsi préparée peut être conservée dans la dernière eau bouillie à + 4°C pendant quelques jours. 11 Etude chimique Le boudin à dialyse contenant l’extrait à dialyser est noué à ses deux extrémités en prévoyant suffisamment d’espace pour les échanges. Il est immergé complètement dans le liquide de contre-dialyse. La formation de gradient de concentration des substances diffusibles dans le liquide contre-dialyse est évitée par agitation magnétique. L’utilisation d’un volume important de liquide de contre-dialyse ou son fréquent renouvellement permet d’accélérer la dialyse (voir schéma en annexe IV).
Table des matières
ABREVIATIONS
GLOSSAIRE
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION GENERALE
PREMIERE PARTIE : ETUDE CHIMIQUE
1 Introduction
2 Matériels et méthodes
2.1 Matériels
2.1.1 La plante
2.1.1.1 Classification
2.1.1.2 Description botanique
2.1.1.3 Distribution géographique
2.1.1.4 Organes utilisés
2.1.2 Les produits chimiques
2.2 Méthodes
2.2.1 Préparation et conservation du matériel
2.2.2 Méthodes d’extraction
2.2.2.1 Extraction à froid
2.2.2.2 Extraction à chaud
2.2.3.1 Traitement par la chaleur
2.2.3.1.1 Principe
2.2.3.1.2 Mode opératoire
2.2.3.2 Fractionnement par le n-butanol
2.2.3.2.1 Principe
2.2.3.2.2 Mode opératoire
2.2.3.3 Précipitation par l’acétate neutre de plomb (ANP)
2.2.3.3.1 Principe
2.2.3.3.2 Mode opératoire
2.2.3.4 Chromatographie sur gel SEPHADEX
2.2.3.4.1 Principe
3 Mode opératoire
3.2.3.4.1.1 Préparation du gel
3.2.3.4.1.2 Dépôt de l’échantillon
3.2.3.5 Dialyse
3.2.3.5.1 Principe
3.2.3.5.2 Mode opératoire
2.2.4 Méthode de concentration
2.2.5 Méthodes d’analyse
2.2.5.1 Chromatographie sur couche mince
2.2.5.1.1 Principe
2.2.5.1.2 Mode opératoire
2.2.5.1.2.1 Dépôt des échantillons
2.2.5.1.2.2 Développement
2.2.5.1.2.3 Révélation
2.2.5.2 Criblage phytochimique
2.2.5.2.1 Les alcaloïdes
2.2.5.2.1.1 Test de MAYER
2.2.5.2.1.2 Test de WAGNER
2.2.5.2.1.3 Test de DRAGENDORFF
2.2.5.2.2 Les stéroïdes et les triterpènes
2.2.5.2.2.14Test de LIEBERMAN
2.2.5.2.2.15Test de SALKO WSKI
2.2.5.2.3 Les désoxyoses: test de KELLER-Kiliani
2.2.5.2.4 Les flavonoïdes et les leucoanthocyanes
2.2.5.2.4.1 Les flavonoïdes : test de WILSTATER (test à la cyanidine)
2.2.5.2.4.2 Les leucoanthocyanes : test de BATE-SMITH
2.2.5.2.5 Les anthraquinones : test de BORNSTRÄGER
2.2.5.2.6 Les tanins et les polyphénols
2.2.5.2.6.1 Test à la gélatine
2.2.5.2.6.2 Test à la gélatine salée
2.2.5.2.6.3 Test au chlorure ferrique
2.2.5.2.7 Les saponines
2.2.5.2.8 Les iridoïdes
3 Résultats
3.1 Extraction
Extraction à froid
11.1.1.1 Extraction aqueuse
11.1.1.2 Extraction hydroalcoolique
11.1.2 Extraction à chaud
11.2 Purification
11.2.1 Traitement par la chaleur
11.2.2 Fractionnement par le n-butanol
11.2.3 Précipitation par l’ANP
11.2.4 Chromatographie sur gel Sephadex G2
11.2.5 Dialyse
11.2.6 Rendement
11.2.7 Degré d’homogénéité des produits
11.3 Propriétés physico-chimiques
11.4 Nature chimique
12 Discussion et conclusion
DEUXIEME PARTIE : ETUDE TOXICOLOGIQUE
1 Introduction
2 Matériels et méthodes
2.1 Matériels
2.1.9 Les animaux d’expérimentation
2.1.9.1 Les souris
2.1.9.2 Les têtards
2.1.9.3 Les poissons
2.1.9.4 Les larves de moustique
2.1.10 Les végétaux d’expérimentation
2.1.11 Les micro-organismes utilisés
2.1.12 Les milieux de culture
2.2 Méthodes
2.2.1 Méthodes d’étude des effets sur les animaux
2.2.1.1 Tests sur les animaux à sang chaud
2.2.1.1.1 Chez la souris
2.2.1.1.1.1 Estimation de la toxicité
2.2.1.1.1.2 Détermination de la DL50
2.2.1.1.1.3 Examen histopathologique
2.2.1.1.1.3.1 Prélèvement et fixation d’organe
31 Inclusion
31.2.1.1.1.3.2Microtomie et étalement des coupes
31.2.1.1.1.3.3Coloration des coupes et montage des lames
2.2.1.1.2 Test hémolytique sur les hématies de mouton
2.2.1.1.2.1 Principe
2.2.1.1.2.2 Mode opératoire
2.2.1.2 Test sur les animaux à sang froid
2.2.1.2.1 Principe
2.2.1.2.2 Mode opératoire
2.2.1.2.2.1 Expérience sur les têtards de grenouille
2.2.1.2.2.2 Expérience sur les poissons: Gambusia holbrooki
2.2.1.3 Test sur les larves de moustique
2.2.2 Méthodes d’étude des effets sur les végétaux
2.2.2.1 Méthodes d’étude des effets sur le pouvoir germinatif
2.2.2.2 Méthodes d’étude des effets sur la croissance de jeunes plantules
2.2.2.2.1 Principe
2.2.2.2.2 Mode opératoire
2.2.2.3 Méthodes d’évaluation des effets sur le développement des bourgeons auxillaires
2.2.3 Méthodes d’études des effets sur la croissance des micro-organismes
2.2.3.1 Stérilisation
2.2.3.2 Isolement et purification des souches
2.2.3.23 Vérification des caractères d’identification des souches
2.2.3.23.1 Observation macroscopique
2.2.3.23.2 Observation microscopique
2.2.3.23.2.1Observation à l’état frais
2.2.3.23.2.2Coloration GRAM
2.2.3.24 Vérification des caractères d’identification biochimique
2.2.3.24.1 Milieu de SIMMONS
2.2.3.24.2 Milieu lysine-fer
2.2.3.24.3 Milieu mannitol-mobilité-nitrate
2.2.3.24.4 Milieu HAJNA-KLIGLER
2.2.3.24.5 Milieu urée-indole
3 Méthodes d’étude des effets sur les germes
3.1.1.1.1 Méthode de diffusion en milieu solide ou méthode de disques
3.1.1.1.1.1 Préparation de l’inoculum
3.1.1.1.1.2 Préparation des extraits
3.1.1.1.1.3 Inoculation des milieux
3.1.1.1.1.4 Méthode de diffusion par disques
3.1.1.1.1.5 Norme de lecture des résultats .
3.1.1.1.2 Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)
4 Résultats
4.1 Effets sur les animaux
4.1.1 Effets sur les animaux à sang chaud
4.1.1.1 Estimation de la toxicité sur souris
4.1.1.1.1 Description des symptômes d’intoxication
4.1.1.1.2 Détermination de la DL50 (24h)
4.1.1.1.3 Examens histopathologiques
4.1.1.2 Effets de l’extrait brut et de l’extrait sur les hématies de mouton
4.1.2 Effets sur les animaux à sang froid
4.1.2.1 Effets de l’extrait sur les têtards de grenouille .
4.1.2.2 Effets de l’extrait sur les poissons Gambusia holbrooki
4.1.2.3 Effets de l’extrait brut sur les larves de moustique
4.2 Effets de l’extrait brut et de l’extrait sur les végétaux .
4.2.1 Effets de l’extrait brut sur le pouvoir germinatif des graines
4.2.2 Effets de l’extrait brut sur la croissance des jeunes plantules de riz et de petit pois
4.2.3 Effets des extraits sur le développement des bourgeons axillaires de petit pois
4.6 Effets des extraits sur les micro-organismes
4.6.1 Isolement et identification des germes
4.6.2 Spectre d’activité anti-microbienne
4.6.3 Détermination de la CMI
5 Discussion et conclusion
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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