Prévalence des gènes de virulence et d’antibiorésistance des Escherichia coli dans les fermes de poulets de chair

Prévalence des gènes de virulence et d’antibiorésistance des Escherichia coli dans les fermes de poulets de chair

 Isolement des souches d’E. coli

 Les différents échantillons collectés ont été analysés au laboratoire de microbiologie de l’EISMV afin d’y isoler les souches d’E. coli. Les méthodes utilisées sont les suivantes :  Isolement à partir des échantillons fécaux • chaque échantillon a été pesé puis homogénéisé dans de l’eau peptonnéetamponnée (EPT), selon le rapport 1/10 (10 ml d’EPT pour 1 g de fèces); • le filtrat a été prélevé et ensemencé sur la gélose Mac Conkey en utilisant pour le premier quadrant, un coton-tige et pour les autres quadrants, une anse à usage unique afin de produire la culture primaire de chaque échantillon fécal; • la gélose et le sachet de bouillon fécal ont ensuite été incubés à 37°C pendant 18 à 20h; • les boîtes ayant présenté une croissance bactérienne suffisante ont été scellées avec un parafilm et conservées à +4°C jusqu’à leur envoi au laboratoire EcL. Lorsque la croissance est insuffisante, d’autres géloses étaient ensemencées à l’aide du bouillon fécal précédemment incubé.  Isolement à partir des eaux de boisson et des eaux de rinçage des carcasses (même protocole) • 250 ml d’eau collectée ont été centrifugés à 8000 tours/mn pendant 15 mn dans des flacons; le surnageant a été jeté en gardant 2 ml du sédiment; • ce sédiment a été prélevé avec une anse et ensemencé sur le milieu Mac Conkey et parallèlement, quelques microlitres ont été prélevés avec une pipette et ensemencés dans un tube contenant 10 ml de TSB; • le Mac Conkey et le TSB ensemencés ont été incubés à 37°C pendant 18 à 20h; • les boîtes de pétri ont ensuite été scellées et conservées à +4°C lorsque la croissance était suffisante; au cas contraire, d’autres géloses étaient ensemencées à l’aide du bouillon TSB précédemment incubé.  Isolement des E. coli à partir des écouvillons de carcasses • les écouvillons ont été sortis de leur étui et ensemencés directement sur des géloses Mac Conkey puis dans 10 ml de bouillon TSB; • après 18 à 20h d’incubation à 37°C de ces milieux, les boîtes sur lesquelles la croissance bactérienne était suffisante ont été scellées et 14 conservées à +4°C. Sinon d’autres géloses Mac Conkey étaient ensemencées à l’aide du bouillon TSB précédemment incubé.

Antibiogramme 

Le test d’antibiogramme n’a concerné, compte tenu de notre séjour limité au laboratoire EcL, que 12 des 32 fermes étudiées. Ainsi, 173 isolats d’E. coli (soit 4 isolats par échantillon provenant des 12 fermes) ont été testés pour leur sensibilité à 15 antibiotiques appartenant à 6 familles. La méthode utilisée est celle de la diffusion sur gélose des disques d’antibiotiques, telle que spécifiée par le « Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ». Les antibiotiques utilisés sont les suivants : l’amikacine (AN), la gentamicine (GM), la kanamycine (K), la streptomycine (S), l’amoxicilline (AMC), l’ampicilline (AM), la cefoxitine (FOX), le ceftiofur (XNL), le ceftriaxone (CRO), la ciprofloxacine (CIP), l’acide nalidixique (NA), le chloramphénicol (C), le sulfisoxazole (G), le triméthoprime-sulfaméthoxazole (SXT) et la tétracycline (TE). A l’exception du chloramphénicol qui est proscrit d’utilisation, ce sont des antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire et/ou en médecine humaine et sur lesquels le PICRA mène une surveillance d’antibiorésistance. Sur le milieu Mac Conkey portant les cultures primaires, 4 isolats lactose positifs ont été choisis pour chaque échantillon et ensemencés distinctement sur la gélose au sang. Au bout de 18 à 20h d’incubation, ils ont été soumis à trois tests biochimiques (indole, citrate et mobilité). Après obtention des critères d’appartenance aux E. coli (indole +, citrate – et mobilité +), chaque isolat a été repiqué sur une nouvelle gélose au sang puis incubé à 37°C pendant 18-20h. Une petite quantité de chaque isolat est inoculé après cette incubation dans un tube contenant 10 ml d’eau distillée stérile. Le contenu du tube est homogénéisé quelques secondes au vortex puis le tube introduit dans l’orifice d’un turbidimètre préalablement calibré. Lorsque ce dernier affiche une turbidité de 50%, la solution est prélevée avec un coton-tige et ensemencée en tapis sur toute la surface d’une gélose Mueller-Hinton. Le milieu Mueller-Hinton ainsi ensemencé est, par la suite séchée pendant 5 mn à la température ambiante et, après dépôt des disques d’antibiotiques à l’aide du distributeur de disques, le milieu est incubé à 37°C pendant 18 à 20h. L’interprétation est faite qualitativement après cette incubation en mesurant le diamètre d’inhibition de la croissance bactérienne, qui se matérialise par un halo clair autour du disque d’antibiotique et en comparant, pour chaque disque d’antibiotique, ce diamètre au standard fourni par le CLSI.

Caractérisation génétique des E. coli  Extraction de l’ADN bactérien 

 Les cultures bactériennes primaires présentes sur le milieu Mac Conkey ont été préparées à l’extraction comme suit : une strie du premier quadrant a été prise avec une anse et ensemencée dans 5 ml de bouillon LB et 5 ml de bouillon mTSB. Après une incubation à 37°C pendant 18-20h, l’ADN a été extrait selon le protocole suivant : chaque échantillon a d’abord été identifié par un code sur un tube de 1,5 ml. Dans ce tube, 1 ml de la culture LB ou mTSB incubée 18-20h à 37°C a été centrifugé pendant 2 mn, à 12000 tours/mn. Le surnageant a été jeté et remplacé par 1 ml de solution tampon (FA buffer). Le culot ayant été remis en suspension à l’aide du vortex, la suspension a encore été centrifugée à 12000 tours/mn pendant 2 mn. Le surnageant a, à nouveau été jeté et remplacé par 500 µl d’eau distillée stérile. Après une remise en suspension (vortex) et un chauffage des tubes pendant 10 mn dans de l’eau portée à ébullition, ils ont été centrifugés une dernière fois à 12000 tours/mn pendant 2 mn. Le surnageant (contenant l’ADN bactérien) de chaque tube a été transféré dans un nouveau tube identifié et conservé à -20°C jusqu’à son utilisation pour la réaction PCR. Il faut préciser que l’ADN extrait du milieu LB a été utilisé pour la recherche des gènes de virulence des ExPEC alors que celui extrait du mTSB (TSB modifié par ajout de sels biliaires) a servi à la recherche des gènes de virulence des STEC. En effet, la recherche des gènes des STEC nécessite qu’il y ait dans le milieu, le moins possible de bactéries autres que les STEC et le rôle des sels biliaires est justement d’inhiber la croissance de ces bactéries indésirables.  Mise au point de la réaction PCR La première étape d’une réaction PCR a consisté à préparer la solution mère ou master-mix (les différents master-mix sont présentés à l’annexe I). Les tubes PCR ont été préparés comme suit : homogénéiser (vortex) le master-mix et mettre 20 µl dans chaque tube PCR portant l’identification de l’échantillon. Ajouter aux 20 µl de master-mix, 5 µl d’extrait d’ADN. Homogénéiser quelques secondes dans une micro-centrifugeuse puis disposer les tubes PCR dans le thermocycleur et faire les cycles de température appropriés (Annexe I). Trois types de réactions PCR ont été effectués : – le premier est celui de deux PCR multiplexes : l’une pour les gènes de virulence des ExPEC (iucD, tsh, papC et cnf) et l’autre pour les gènes de virulence des STEC (eae, stx1 et stx2). Ces PCR ont porté chacune sur les 118 échantillons. Le Tableau IV présente les gènes testés, les séquences d’amorces de ces gènes ainsi que les contrôles positifs utilisés dans chaque PCR.