Préparation d’inoculum et inoculation

Préparation d’inoculum et inoculation

L’inoculum est préparé à partir d’une culture mycélienne d’isolats de P. infestans âgée de 3 semaines, en versant 10 ml d’eau distillée stérilisée dans la boite. A l’aide d’une lame de scalpel la surface mycélienne est grattée et la suspension de sporocystes ainsi récupérée est passée au vortex pendant 1 minute. La suspension sporale est versée dans un pulvérisateur de laboratoire stérile afin d’asperger les différents organes aériens de la plante (figure 13 et 14). Le témoin est constitué de fruits et folioles pulvérisés avec de l’eau distillée (Belkhiter, 2013). 24 Figure 13 : Préparation de l’inoculum. Figure 14 : Inoculation des folioles et fruits.

Pathogénicité de Pythium 

Préparation des pots Des pots de 1,5 kg de contenance, sont préalablement nettoyés et remplis de sol stérilisé à l’étuve puis humidifié avec de l’eau distillée stérilisée.  Préparation de la suspension sporale et inoculation La préparation de l’inoculum est réalisée de la même manière que précédemment. Des graines de la tomate de variété Heinz, sont trempées dans la suspension sporale pendant quelques minutes avant d’être semées dans les pots. L’opération a été répétée trois fois et le témoin est constitué de graines imbibées auparavant dans de l’eau distillée stérilisée. Quinze graines ont été semées par pot. 

Etudes in vitro des propriétés antagonistes des Trichoderma sur les isolats de Phytophthora et Pythium

Pour l’étude in vitro, des propriétés antagonistes des Trichoderma sur les souches de Phytophthora et de Pythium, deux techniques ont été utilisées : le test de confrontation directe 25 et le test de confrontation à distance. Les souches de Trichoderma utilisées dans nos essais proviennent de la collection du Laboratoire de Biotechnologies des Champignons du département de Biologie Végétale de l’Université Cheikh Anta DIOP de Dakar. Elles ont été isolées à partir de la rhizosphère de plantes de tomate de différents sites de la zone des Niayes. Il s’agit des souches de Trichoderma asperellum : 

Méthodes de confrontation directe

Encore appelée technique des cultures opposées, la méthode de confrontation directe a été décrite par Sivan et Chet, (1989). Elle consiste à placer dans une même boite de Pétri contenant 15 ml de milieu PDA deux explants de 5 mm de diamètre distants de 4 cm l’un de l’autre. L’un des explants provient de cultures de la souche antagoniste (Trichoderma) à tester et l’autre explant de l’agent pathogène impliqué (Pythium ou Phytophthora). Les témoins sont représentés par des boites de Pétri contenant uniquement le champignon pathogène (Pythium ou Phytophthora).

Les repiquages des souches (pathogènes et antagonistes) sont effectués au même moment et l’incubation est réalisée à 25°C. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque traitement. Figure 15 : Confrontation directe entre Trichoderma et souche pathogène. 2. Méthode de confrontation à distance Le principe de cette technique consiste à déposer au centre de chaque boîte de Pétri contenant le milieu PDA un explant de 8 mm de diamètre prélevé à partir des colonies de Trichoderma et des souches de Pythium ou de Phytophthora (figure 16). Après 24 heures d’incubations, la partie inférieure contenant le Trichoderma est scellée avec une autre contenant le pathogène ; par une bande de parafilm de façon à éviter toute contamination et toute perte de gaz. Comme pour la première expérimentation, trois répétitions ont été réalisées.

Les témoins sont Trichoderma Pathogène 26 représentés par des boites contenant à la face inférieure uniquement le milieu de culture et la supérieure l’agent pathogène (Pythium ou de Phytophthora). Figure 16 : Confrontation à distance entre Trichoderma et souche pathogène. 3. Paramètres mesurés La croissance mycélienne des pathogènes a été mesurée quotidiennement pendant 6 jours d’incubation par la mesure du diamètre du mycélium du champignon pathogène.

Le calcul du taux d’inhibition des pathogènes par les isolats de Trichoderma testés ; s’est fait ; suivant la formule proposée par Sy, (1986) et Vincent, (1990). IC%= (DT-DPA) /DTx100 Où DT : diamètre moyen des colonies témoins. DPA : diamètre moyen des colonies en présence de l’antagoniste. IC% : Taux d’inhibition de la croissance mycélienne du pathogène. Pour Phytophtora, le taux d’inhibition ainsi que l’évolution de la croissance mycélienne ont été déterminés aussi bien pour le test de confrontation directe que pour le test de confrontation à distance. Cependant, pour Pythium, seul le taux d’inhibition a été déterminé après les 6 jours d’incubation lors des deux tests. Pour les tests de confrontation directe, l’activité mycoparasitaire des isolats de Trichoderma a été déterminée après 15 jours d’incubation en utilisant l’échelle de Belle et al., (1982) pour estimer la capacité des souches à envahir ou non les pathogènes.