Préparation de la crème de base

MATERIELS ET METHODES

Partie chimique

Extraction

Les feuilles de la plante utilisées dans ce mémoire ont été récoltées à la fin du mois de Janvier 2016, dans la région Nord de Madagascar, dans la commune de Joffre-Ville. Elles ont été séchées dans un endroit aéré, à l’abri de la lumière. Les feuilles (250g) ont été broyées à l’aide d’un broyeur à marteau électrique au LPGPC. La poudre obtenue a été macéré dans un mélange alcool-eau (60 : 40) dans un récipient en verre, pendant 5 jours.
Le macérât a été filtré à l’aide d’un coton, puis le filtrat a été évaporé dans un distillateur à la température de 80°C. L’extrait obtenu a été codé NJ015, puis pesé afin de calculer le rendement de l’extraction selon la formule :

Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique, suivant la méthode décrite par FONG H.H.S et ses collaborateurs (1977), a été utilisé afin de détecter les familles chimiques présentes dans la plante. Cette méthode est basée sur la formation de complexes insolubles ou de complexes colorés, entre des réactifs spécifiques et les familles chimiques correspondantes dans l’extrait NJ015 (tableau I).
Les signes suivants ont été utilisés pour exprimer la teneur des familles chimiques dans l’extrait:
– : absence de la famille chimique recherchée
+ : présence en faible teneur
++ : Présence en moyenne teneur
+++ : Présence en forte teneur

Partie pharmacologique

Ce travail a pour objectif d’étudier l’activité cicatrisante de l’extrait NJ015 sur des plaies expérimentales. Il a été appliqué sous forme de crème à 10 % par voie topique. Son effet sur les différentes phases de la cicatrisation a été étudié. La vitesse de cicatrisation a été calculée et les plaies ont été photographiées tous les jours.

Préparation de la crème de base

Plusieurs types galéniques sont disponibles pour une application topique : pommade, crème, lotion et patch. Dans le présent travail, l’extrait a été appliqué sous forme de crème « eau dans huile », où la phase dispersée est constituée par la ph ase aqueuse, et la phase dispersante est constituée par la phase grasse. Dans la crème de base, la phase aqueuse est constituée d’un mélange d’eau distillée et du bicarbonate de sodium ; tandis que la phase grasse est constituée d’huile de tournesol, de la cire d’abeille, du stéaryle alcool et de l’acide stéarique (tableau II)(ALLO O. et coll., 2005).

Préparation de la crème avec 10 % de l’extrait NJ015 

Pour préparer la crème utilisée dans ce travail, l’extrait a été incorporé dans la crème de base à une proportion de 10 % du poids total. Pour préparer 5g de crème NJ015, une quantité de 0,5g de l’extrait ont été mélangés avec 4,5g de crème de base. Le tout a été bien mélangé afin d’obtenir une crème contenant 10 % de l’extrait NJ015 (MOGOSANU G. D., 2014).

Animaux d’expérimentation

Des rats mâles de race Wistar pesant de 105 à 170 g ont été utilisés. Ils ont été élevés sous les conditions locales du laboratoire de Pharmacologie Générale, de Pharmacocinétique et de Cosmétologie, à la faculté des Sciences, Université d’Antananarivo. Ils ont été nourris avec de la provende LFL1420, et ont eu accès libre à l’eau. Ils ont été soumis à un cycle de lumière et d’obscurité de 12h/12h, et à la température de 20°C. Ces rats ont été répartis en deux lots, les rats du premier lot ont servi de témoin et ceux du deuxième lot ont été traités avec l’extrait NJ015.

Préparation des animaux

Des plaies expérimentales ont été créées dans la partie dorsale des animaux, au niveau de l’omoplate, pour étudier l’activité cicatrisante de l’extrait NJ015. Cette partie a été rasée, puis épilée à l’aide d’une cire épilatoire tiède et des bandelettes pour épilation. Les animaux ont été ensuite anesthésiés à l’aide d’un coton imbibé d’éther diéthylique (MORTON J.J.P. et MALONE, 1972). Deux plaies circulaires de 1cm de diamètre, placées symétriquement de part et d’autre de la colonne vertébrale, ont été créées à l’aide d’un dispositif comportant une lame tranchante circulaire de 1cm de diamètre (BALAZS L., 2001).

Etude de l’activité cicatrisante

L’effet cicatrisant de l’extrait a été étudié en observant l’état quotidien des plaies, afin de déterminer son évolution à chaque étape de la cicatrisation. Après la création des plaies, les animaux ont été répartis en 2 lots : un lot témoin traité avec la crème de base, et 1 lot traité avec la crème contenant 10 % de l’extrait NJ015. Tous les jours, à la même heure, avant d’appliquer les crèmes, les plaies ont été nettoyées. Un coton imbibé d’eau distillée a été placé sur la plaie afin de ramollir la croûte, ensuite cette dernière a été enlevée à l’aide d’un coton-tige mouillé, et la surface de la plaie a été séchée à l’aide d’un papier buvard.
Après nettoyage de la plaie, sa surface a été mesurée par planimétrie directe, en posant un papier millimétré transparent sur la plaie et en traçant son contour sur le papier à l’aide d’un crayon à bout pointu (NAYAK B. S et PINTO PERREIRA L. M., 2006).
Après la mesure de la surface de la plaie, 10 mg de la crème contenant 10 % de l’extrait NJ015 a été appliquée par voie topique sur chaque plaie des animaux du lot traité avec l’extrait, et la même quantité de crème de base a été appliquée sur la plaie des animaux du lot témoin (MAVIYA N., et SANJA, 2009).

Etude de l’activité de NJ015 sur l’hémostase

L’hémostase commence par une vasoconstriction qui arrête le saignement, et se termine par la formation d’une croûte. Vingt-quatre heures après la création de la plaie, une croute a été observée sur les plaies (FOIT M., 2013).

Etude de l’activité de NJ015 sur la phase inflammatoire

Un cicatrisant peut diminuer la durée de la phase inflammatoire. Cette phase est caractérisée par la rougeur et l’œdème au niveau des berges des plaies, ainsi que l’exsudat au niveau de la surface des plaies (DELEAGE A., 2011). Pour étudier l’effet de l’extrait NJ015 sur la phase inflammatoire, la durée de ces différents signes inflammatoires sur les plaies a été notée.

Etude de l’activité de NJ015 sur la phase proliférative

Cette phase est caractérisée par l’apparition du tissu de granulation et se termine par la formation d’une membrane épithéliale de couleur rose. (DELEAGE A., 2011). L’effet de l’extrait sur la phase de granulation a été étudié en observant le temps d’apparition du tissu de granulation au niveau de la surface des plaies, et en comptant le nombre de granulation, ainsi que l’apparition de la membrane épithéliale qui recouvre la plaie. L’effet de l’extrait NJ015 sur cette phase a aussi été étudié en observant le temps de la fermeture de la plaie.

Expression et analyses des résultats

Les résultats obtenus ont été exprimés sous forme de moyenne ± écart type réduit. Les moyennes du lot traité avec l’extrait NJ015 ont été comparées avec celles du lot témoin, en utilisant le test « t » Student, avec un degré significatif de p< 0,05.

RESULTATS

PARTIE CHIMIQUE

Rendement de l’extraction

A partir de 250 g de poudre macérée dans un mélange éthanol-eau (40 : 60), 20 g d’extrait sec de NJ015 sont obtenus, soit un rendement de 8 %.

Les familles chimiques présentes dans NJ015

Le criblage phytochimique effectué sur l’extrait NJ015 révèle une forte teneur en alcaloïdes, en tanins et en polysaccharides ; des saponines, des stéroïdes triterpènes, des flavonoïdes et des composés phénoliques en teneur moyenne, et des sucres réducteurs en faible teneur (Tableau III).

PARTIE PHARMACOLOGIQUE

Effet de l’extrait NJ015 sur l’hémostase

L’observation de la plaie montre l’apparition d’une croûte sur les plaies traitées avec l’extrait NJ015 après 24h. Par contre, elle est absente chez le lot témoin (figure 1) et n’apparait qu’au bout de 48h.

Effet de l’extrait NJ015 sur la phase inflammatoire

Au deuxième jour (J2), toutes les plaies présentent des signes d’inflammation, une rougeur, un œdème au niveau de la berge et de l’exsudat au niveau de la surface des plaies. Au 4 ème jour, les plaies traitées avec l’extrait NJ015 ne présentent plus de signes d’inflammation, alors que ceux-ci persistent chez le lot témoin (figure 2). L’application quotidienne de l’extrait NJ015 sous forme de crème réduit la durée de la phase inflammatoire.

Effet de l’extrait NJ015 sur la phase de prolifération

Des granulations apparaissent au niveau de la surface des plaies traitées avec l’extrait NJ015 au 5 ème jour, celle du témoin présente encore des signes d’inflammation (figure 3).
La membrane épithéliale est présente sur la surface de la plaie traitée avec NJ015 au J7, par contre chez le lot témoin, des tissus de granulations apparaissent en ce moment (figure 4).

DISCUSSION

Ce travail a eu pour objet d’étudier l’activité cicatrisante de l’extrait de plante codé NJ015 sur une plaie expérimentale, en l’appliquant quotidiennement sous forme de crème (10 %). Nos résultats montrent que la crème contenant 10 % d’extrait NJ015 diminue la durée de la cicatrisation, accélère l’hémostase, diminue la durée de la phase inflammatoire, accélère la formation des bourgeons charnus et la fermeture des plaies.
D’après nos observations, la croûte des plaies traitées avec de l’extrait NJ015 apparaît avant celle des plaies témoins. Elle protège la plaie contre la contamination (FLANAGAN M. et coll., 2000). Son apparition précoce nous permet de dire que l’extrait accélère l’hémostase, et empêche la contamination de la plaie, ce qui contribuerait à son activité cicatrisante, commele font les tanins qui activent le facteur XII de coagulation, et provoquent une vasoconstriction (LIETE et coll., 2002).
Nous avons également constaté que la durée de la phase inflammatoire a diminué chez les plaies traitées avec l’extrait par rapport à celles du lot témoin. Pendant cette période, les cellules inflammatoires telles que les leucocytes, les neutrophiles et les macrophages, assurent le nettoyage de la plaie et la protègent contre les agents infectieux (MATHIEU P.R. et coll., 2010). La diminution de la phase inflammatoire pourrait s’expliquer par la présence précoce de croûte à la surface des plaies car celle-ci protège la plaie contre les agents infectieux provenant de l’extérieur, et assurent l’humidité de la plaie. La migration des cellules inflammatoires vers le tissu lésé ainsi que la propagation des messages chimiotactiques nécessitent cette humidité (ZAHIR M., 1965). Le raccourcissement de la durée de cette phase chez la plaie traitée avec l’extrait expliquerait qu’il participe à l’élimination des corps étranger.
Des études effectuées sur les feuilles d’Ocimum celtidifolia rapportent que les polysaccharides possèdent des effets antiinflammatoires en renforçant le système immunitaire (TOGOLA et coll., 2007). Ceci nous permet d’avancer l’hypothèse que la réduction de la phase inflammatoire chez les plaies traitées pourrait être due aux polysaccharides présents dans l’extrait NJ015. D’autre part, les flavonoïdes possèdent un effet antioxydant. Ils protègent les cellules en piégeant les radicaux libres produits par les neutrophiles, qui retardent la cicatrisation (HAVSTEEN B. H., 2002). Or, le criblage phytochimique effectué sur l’extrait NJ015 montre qu’il renferme des flavonoïdes. Nous pouvons ainsi avancer que l’effet combiné des tanins et des flavonoïdes présents dans l’extrait NJ015, serait le responsable de la diminution de la phase inflammatoire.
La réduction de la phase inflammatoire du lot traité expliquerait l’apparition précoce des bourgeons. Lorsque la plaie est suffisamment nettoyée par le processus inflammatoire, les macrophages et les kératinocytes libèrent des facteurs de croissance qui stimulent l’angiogenèse (KISHOR B.M. et coll., 2011). Ce tissu de granulation approvisionne les cellules en éléments nutritifs afin de combler le vide laissé par la lésion. Il constitue une matrice provisoire qui permet la migration des cellules endothéliales, des cellules inflammatoires et des fibroblastes au niveau du tissu lésé. L’accélération de la prolifération des granulations au niveau de la surface des plaies traitées avec l’extrait NJ015 pourrait s’expliquer par l’activation des fibroblastes des cellules saines au voisinage de la plaie dans l’angiogenèse (DIANE S.C., 2012). Ce qui expliquerait aussi la réépithélialisation des plaies traitées avec l’extrait avant celle des plaies témoins (KISHOR B.M. et coll., 2011). Enfin, lorsque les bourgeons couvrent la surface de la plaie, les fibroblastes se transforment en myofibroblastes, qui en se contractant, tirent le bord des berges de la plaie vers le centre, et ferment les plaies (STEPHAN B. et coll., 2008). L’accélération de la phase proliférative favorise la fermeture des plaies traitées avec l’extrait NJ015 plus tôt par rapport à celle les plaies témoins. L’approvisionnement en sang diminue et les kératinocytes migrent vers le tissu de granulation.
Des études plus approfondies portant sur sa purification et des études histologiques seraient nécessaires afin de mieux expliquer le mécanisme d’action de l’extrait NJ015 sur son activité cicatrisante.

CONCLUSION

Les résultats obtenus montrent que l’extrait NJ015 possède une activité cicatrisante. Il raccourcit la phase hémostatique et la phase inflammatoire, il accélère également l’apparition des granulations. Cette activité cicatrisante serait due à la présence des polysaccharides, des flavonoïdes ou des tanins. Des études approfondies sur des produits purs issus de la purification de cet extrait, et des études histologiques de la peau au cours du traitement, seraient nécessaires afin de mieux expliquer son mécanisme d’action.

Table des matières

Table des matières 
LISTE DES TABLEAUX 
LISTE DES FIGURES 
LISTE DES ABREVIATIONS
I. INTRODUCTION 
II. MATERIELS ET METHODES
A. Partie chimique
1. Extraction
2. Criblage phytochimique
B. Partie pharmacologique
1. Préparation de la crème de base
2. Préparation de la crème avec 10 % de l’extrait NJ015
3. Animaux d’expérimentation
4. Préparation des animaux
5. Etude de l’activité cicatrisante
a. Etude de l’activité de NJ015 sur l’hémostase
b. Etude de l’activité de NJ015 sur la phase inflammatoire
c. Etude de l’activité de NJ015 sur la phase proliférative
C. Expression et analyses des résultats
III. RESULTATS 
A. PARTIE CHIMIQUE
1. Rendement de l’extraction
2. Les familles chimiques présentes dans NJ015
B. PARTIE PHARMACOLOGIQUE
1. Effet de l’extrait NJ015 sur l’hémostase
2. Effet de l’extrait NJ015 sur la phase inflammatoire
3. Effet de l’extrait NJ015 sur la phase de prolifération
4. Effet de l’extrait NJ015 sur la cicatrisation
IV. DISCUSSION 
V. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE