Pourquoi le Ri7 est-il séquestré dans les cellules endothéliales ?

Accumulation et internalisation de l’anticorps monoclonal Ri7 au sein des cellules endothéliales du cerveau

Transport d’acides nucléiques dans les cellules endothéliales du cerveau via l’utilisation de nanoparticules

La thérapie génique représente une approche novatrice très intéressante pour le traitement des maladies neurodégénératives. Cependant, son développement est grandement limité par l’instabilité systémique des acides nucléiques suite à leur administration. De plus, pour cibler le cerveau, le problème à résoudre est d’autant plus ardu, car les acides nucléiques sont incapables d’internaliser et de franchir les CECCs. Afin que les maladies du SNC puissent bénéficier de stratégies innovatrices comme la thérapie génique, il est important de développer des approches permettant l’accumulation d’acides nucléiques au cerveau. Dans le but d’étudier le transport d’acides nucléiques au cerveau, nous avons utilisé deux types de nanoparticules différentes, soit une formulation micellaire polyionique et une formulation d’immunoliposomes. Dans la première étude avec les micelles, nous utilisons un fragment Fab’ de l’anticorps Ri7 et pour la deuxième étude, le Ri7 complet, afin de cibler le RTf. Nous avons observé dans les deux études que les deux formulations de nanoparticules étaient incorporées par endocytose via leur liaison avec le RTf. De plus, nos analyses de quantification in vitro par analyse de colocalisation en microscopie confocale suggèrent que les micelles ciblant le RTf évitent en grande partie la dégradation lysosomale, et ce même après une incubation de 24 h. Bien que qualitatives, les expériences de colocalisation avec les liposomes suggèrent aussi une accumulation partielle des liposomes ciblant le RTf au niveau des lysosomes. Par la suite, des injections systémiques chez la souris Tie2GFP ont démontré la capacité des micelles et des liposomes ciblant le RTf à transporter des acides nucléiques au niveau des CECCs. L’accumulation du signal fluorescent provenant du matériel génétique encapsulé dans les différentes nanoparticules suggère fortement que ces deux formulations sont internalisées et pourrait donc servir de vecteur pour le développement de thérapie génique afin de rétablir les dysfonctions endothéliales.

Discussion générale sur le projet et perspectives

La microscopie, une méthode de choix pour l’étude du ciblage thérapeutique au cerveau Le premier résultat frappant obtenu durant cette thèse est la démonstration autant en microscopie en fluorescence qu’en microscopie électronique que l’AcM ciblant le RTf est en fait séquestré dans les CECCs (Paris-Robidas et al. 2011, Paris-Robidas et al. 2016). Les premières études effectuées avec des AcMs ciblant le RTf, dont plusieurs utilisant le clone Ri7, suggéraient que les AcMs traversaient les CECCs par transcytose et allaient s’accumuler dans le parenchyme cérébral (Bickel et al. 1994, Pardridge et al. 1994, Lee et al. 2000, Shi et al. 2001b). Cependant, en étudiant de plus près plusieurs de ces publications, on remarque que très peu d’articles s’attardent à démontrer la distribution cérébrale par une approche de microscopie. En effet, beaucoup de ces études concluent à une accumulation dans le parenchyme cérébral suite à des mesures directes (AcM radiomarqués) ou indirectes (activité enzymatique) sur un homogénat de cerveau, sans aucune discrimination entre les capillaires et le tissu cérébral (Lee et al. 2000, Shi et al. 2001a, Shi et al. 2001b, Zhang et al. 2003b). Cependant, dans ces conditions il est impossible de savoir si l’accumulation cérébrale est due à une internalisation dans les CECCs ou à une pénétration dans le parenchyme.
La déplétion capillaire a été développée pour séparer le parenchyme cérébral des vaisseaux sanguins (Triguero et al. 1990). Cette technique permet à l’aide d’un gradient de faire culotter les vaisseaux qui sont plus denses que les cellules neuronales. Cependant, cette technique possède certaines limitations, dont la principale étant la contamination de la fraction post-vasculaire par des capillaires et vice-versa. En effet, il existe des tests se basant sur l’activité d’enzyme spécifique aux CECCs (alcaline phosphatase, -GT) permettant d’évaluer la pureté de chaque fraction. Il a été démontré à plusieurs reprises que la proportion des AcM ciblant le RTf était en fait équivalente à la proportion d’enzymes spécifiques aux CECCs retrouvées dans le surnageant (Moos et al. 2001, Paris-Robidas et al. 2016). Ces résultats suggèrent une contamination du surnageant par les capillaires et non une réelle pénétration dans le parenchyme cérébral (Moos et al. 2001, Paris-Robidas et al. 2016). De plus, des expériences d’immunofluorescence non publiées de notre laboratoire ont aussi démontré que la fraction contenant les capillaires cérébraux peut être contaminée par des cellules neuronales et astrocytaires soulignant ainsi l’importance d’utiliser une approche de microscopie afin de bien visualiser la distribution cérébrale des AcM utilisés. De plus, les résultats présentés dans les chapitres 2 et 3 de cette thèse montrent aussi l’intérêt de combiner dans une même étude plusieurs approches de microscopie. La microscopie en fluorescence est idéale pour effectuer des analyses de colocalisation, mais la limite de résolution de la majorité des microscopes ne permet pas de bien discriminer la superposition de deux éléments à proximité. Il est difficile avec la fluorescence de distinguer si une molécule est à l’intérieur d’une cellule ou tout juste à l’extérieur de la membrane plasmique. Cependant, la très haute résolution de la microscopie électronique permet de trancher sur la question et aussi de faire des observations au niveau subcellulaire. Cependant, les analyses de microscopie électronique sont basées sur des observations morphologiques (apparence, taille, position, densité) et peuvent être biaisées par l’orientation du tissu. De plus, la microscopie électronique permet difficilement d’avoir une vue globale sur l’étendue du marquage. Le développement de nouveaux microscopes à haute résolution en fluorescence pourrait cependant permettre de grandement améliorer la qualité de futures analyses de colocalisation.
Connaître les principaux tissus ou types cellulaires ciblés par l’anticorps Ri7 permettra de mieux développer d’éventuels nouveaux traitements et de par la suite faciliter leur transition vers la clinique. Cependant, la microscopie comporte un certain désavantage, car il s’agit d’une technique peu quantitative. Dans le but d’effectuer du ciblage thérapeutique, il est tout aussi essentiel de pouvoir quantifier l’accumulation cérébrale ou endothéliale. La perfusion cérébrale in situ (PCIS) a été développée tout d’abord chez le rat (Takasato et al. 1984) et adaptée chez la souris (Dagenais et al. 2000) par la suite pour justement permettre de mesurer le passage au cerveau des molécules. Par ailleurs, notre équipe a récemment adapté cette technique à l’utilisation de molécules fluorescentes (Alata et al. 2014). Cette méthodologie permet d’une part de connaître les concentrations exactes qui atteignent le cerveau facilitant ainsi les calculs de pharmacocinétique associés et aussi d’éviter le métabolisme du foie pouvant générer des métabolites qui eux seraient capables de passer la BHE (Takasato et al. 1984).
De plus, il est important de mentionner que l’approche par microscopie nous a permis de confirmer nos résultats par détection immunologique à l’aide d’anticorps secondaires fluorescents ou couplés à des billes d’or. Suggérant ainsi que l’ajout d’un cargo aux AcMs ne semble pas affecter leur capacité à traverser la BHE (Paris-Robidas et al. 2011, Paris-Robidas et al. 2016). Afin de mieux développer de futurs protocoles basés sur le ciblage des systèmes de transport de la BHE, il serait important de combiner des approches quantitatives avec la microscopie. Malheureusement, une lacune dans la caractérisation de la distribution cérébrale des anticorps et/ou peptides ciblant le BHE est observée de manière généralisée dans les publications portant sur le ciblage thérapeutique au cerveau. En effet, au courant des dernières années, on remarque dans plusieurs publications marquantes dans le domaine du ciblage thérapeutique un manque au point de vue de la caractérisation des anticorps et molécules utilisés (Yu et al. 2011, Couch et al. 2013, Yu et al. 2014, Zuchero et al. 2016). Comme ces travaux sont bien souvent menés de front par des équipes de recherche de haut calibre, on peut se questionner à savoir pourquoi cette étape clé dans leur preuve de concept a été omise. De plus, comme plusieurs vecteurs font l’objet de brevets et sont la propriété exclusive de compagnies, il est difficile voir impossible pour des équipes indépendantes de reproduire les résultats.

Pourquoi le Ri7 est-il séquestré dans les cellules endothéliales ?

Les anticorps ciblant le RTf ont fait l’objet de nombreuses publications (Huwyler et al. 1996, Lee et al. 2000, Moos et al. 2001, Gosk et al. 2004, Paris-Robidas et al. 2011, Yu et al. 2011, Alata et al. 2014, Bien-Ly et al. 2014, Paris-Robidas et al. 2016). Certaines de ces publications ont par ailleurs fait la démonstration de l’accumulation endothéliale de tels anticorps (voir tableau 12).
Tableau 12 : Résumé des diverses publications montrant une accumulation endothéliale des anticorps ciblant le récepteur de la transferrine
Cependant, une question reste en suspens, pourquoi ces AcM restent-ils séquestrés dans les CECCs ? Pour répondre à cette question, il faut se pencher sur le mécanisme du transport de la Tf au cerveau. Il est important de mentionner que le transport du fer et de la Tf au cerveau fait toujours l’objet d’un débat. En effet, la démonstration que les CECCs étaient capables d’internaliser la Tf par endocytose (Fishman et al. 1987, Pardridge et al. 1987) a rapidement mené à la conclusion que la Tf était acheminée vers le tissu neuronal par transcytose (Fishman et al. 1987, Pardridge 1988). Cependant, des études ont démontré que l’accumulation cérébrale du fer excédait grandement celle de la Tf réfutant ainsi en partie l’hypothèse de la transcytose de la Tf (Taylor et al. 1990. Une explication alternative propose que le complexe fer-Tf serait internalisé par les CECCs et une fois acheminé vers les endosomes, le fer se détacherait de la Tf suite à l’acidification des endosomes et serait transporté dans le cytosol des cellules {Moos, 2000 #494, Taylor et al. 1991, Morris et al. 1992, Moos et al. 2007). Par la suite, l’apo-Tf, ayant une forte affinité pour le RTf à pH acide, serait recyclée à la membrane plasmique où le pH physiologique entraînerait le détachement de l’apo-Tf (Moos et al. 2000, Moos et al. 2007). De manière similaire, les premiers résultats évoquant l’internalisation des AcMs ciblant le RTf ont mené à la conclusion hâtive que ces mêmes AcMs traversaient la BHE par transcytose (Friden et al. 1991, Pardridge et al. 1991, Bickel et al. 1994). Cependant, nos études suggèrent que le Ri7 aurait une forte affinité pour son récepteur et cette affinité ne semblerait pas affectée par le pH plus acide des endosomes (Paris-Robidas et al. 2011, Paris-Robidas et al. 2016).
Comme il semble exister un lien étroit entre l’affinité de la Tf pour son récepteur et sa capacité à effectuer de la transcytose, il est possible de penser que l’affinité des AcM ciblant le RTf agit de manière similaire. Cette hypothèse a d’ailleurs été étudiée par un groupe de recherche et fait l’objet de plusieurs publications (Yu et al. 2011, Bien-Ly et al. 2015, Zuchero et al. 2016). Dans ces publications, cette équipe a employé une stratégie assez simple, soit d’utiliser un AcM ayant une forte affinité pour le RTf (IC50 : 1.7  0.1 nM) et de développer différentes variations de l’AcM avec des affinités plus faibles (IC50 : 6.9  0.4, 65  12 and 111  16 nM) (Yu et al. 2011). Dans leurs études, ils ont démontré qu’une diminution de l’affinité engendrait une augmentation de l’accumulation au niveau neuronal (Yu et al. 2011, Bien-Ly et al. 2015, Zuchero et al. 2016). De plus, une de leurs études suggère qu’une forte affinité de l’AcM pour le RTf entraînerait une dégradation massive du RTf via le lysosome et pourrait donc affecter l’efficacité d’un éventuel traitement (Bien-Ly et al. 2014). Plusieurs études se sont intéressées à l’affinité de l’AcM Ri7 pour le RTf (Lesley et al. 1984b, Bjorn et al. 1987, Alata et al. 2014). Une première étude en 1984 sur un modèle in vitro a permis d’estimer son Kd entre 0.17 – 2.5 nM. Par la suite, Bjorn et collaborateurs ont obtenu des résultats similaires en estimant le Kd de l’anticorps entre 1 – 2 nM (Bjorn et al. 1987). Dans notre laboratoire, des études de pharmacocinétique en PCIS ont permis de mesurer qu’une concentration de 500 nM était nécessaire pour saturer in vivo le RTf (Alata et al. 2014). De plus, des résultats préliminaires non publiés de notre équipe ont estimé l’affinité du Ri7 conjugué avec une molécule fluorescente entre 10 – 20 nM. Bien que les valeurs diffèrent légèrement selon les méthodes expérimentales utilisées, toutes ces études suggèrent que le Ri7 possède une forte affinité pour le son récepteur.
Comme ces études le suggèrent, il est fort probable que cet AcM soit en fait incapable de se détacher de son récepteur. En effet, nos résultats démontrent principalement une restriction du Ri7 dans les CECCs suite à l’injection systémique de l’AcM seul ou de l’AcM conjugué avec les NPs. En microscopie électronique, nous avons pu observer l’incorporation du Ri7 conjugué avec des points quantiques au niveau de différentes structures subcellulaires (vésicules, structures tubulaires, endosomes tardifs, lysosomes) des CECCs. Malgré la sensibilité de cette méthode, nous n’avons observé qu’une infime, voire artéfactuelle, accumulation des AcM dans le parenchyme cérébral. Cette faible accumulation peut, par ailleurs, être due à une interaction entre le Ri7 et le récepteur des IgG (FcRn) (Cooper et al. 2013, St-Amour et al. 2013). Cependant, nous avons aussi obtenu un résultat intrigant suite à l’injection systémique de NPs conjuguées avec un fragment Fab’ de l’AcM Ri7. Le fragment Fab étant la partie de l’AcM responsable de la reconnaissance de l’antigène, les fragments conservent leur capacité de ciblage, mais en offrant quelques avantages dus entre autres à l’absence de la portion Fc (Mariani et al. 1991, Maynard et al. 2000, Beck et al. 2010). Lors de ces expériences chez la souris Tie2GFP, nous avons observé une faible pénétration de la NP dans le parenchyme cérébral. Cette possible accumulation dans le tissu cérébral pourrait être due à une diminution de l’avidité du fragment Fab’Ri7 pour le RTf en comparaison avec l’IgG complet. En effet, une récente étude a démontré que l’avidité de l’AcM pour sa cible pouvait aussi influencer la pénétration des anticorps ciblant le RTf dans le parenchyme (Niewoehner et al. 2014, Urich et al. 2015). Leurs travaux ont rapporté que des fragments Fab ayant une avidité moins forte pour le RTf du à leur mode de liaison monovalent pénétraient davantage dans le cerveau (Freskgård et al. 2014, Niewoehner et al. 2014, Urich et al. 2015).

La forte affinité, un avantage ou un désavantage ?

Au cours des dernières années, plusieurs publications ont mis de l’avant le lien entre l’affinité d’un AcM pour sa cible ainsi que son taux de pénétration au cerveau (Yu et al. 2011, Couch et al. 2013, Bien-Ly et al. 2014, Zuchero et al. 2016). Selon les auteurs de ces publications, l’utilisation des AcMs de forte affinité serait à proscrire, car en plus d’avoir une accumulation limitée aux CECCs, les AcMs de forte affinité entraîneraient une dégradation massive du RTf via le lysosome (Yu et al. 2011, Couch et al. 2013, Bien-Ly et al. 2014, Zuchero et al. 2016). Cependant, nous avons quantifié les niveaux de RTf sur les CECCs suite à l’injection répétée chez la souris de deux différentes formulations de nanoparticules et dans aucun cas nous n’avons observé une baisse des niveaux du récepteur. De plus, nos analyses d’immunofluorescence sur les cellules N2A démontrent une colocalisation partielle avec le lysosome. Contrairement aux données publiées par Bien-Ly et collaborateurs (Bien-Ly et al. 2014), bien que nos résultats suggèrent une certaine accumulation lysosomale, cette accumulation ne semble pas assez importante pour déclencher de dégradation massive du RTf.
L’utilisation des AcM de faible affinité présente aussi un problème majeur, car la dose nécessaire à injecter pour obtenir une accumulation cérébrale significative doit être très élevée (Yu et al. 2011). En effet, la diminution de l’affinité de l’AcM faciliterait grandement son détachement non seulement près de la membrane abluminale, mais à tout moment suite à sa liaison au récepteur (Rudnick et al. 2009). Tel qu’illustré dans la publication de Yu et collaborateurs (Figure 41) l’injection d’une faible quantité d’un AcM possédant une faible affinité entraîne une accumulation cérébrale très limitée (Yu et al. 2013). Il est donc facile d’assumer que l’utilisation en clinique avec des doses dites thérapeutiques de ce type d’anticorps entraînera des coûts de traitement imposants (Lajoie et al. 2015).