pour renforcer la lutte contre la Tuberculose bovine

Le test de dosage d’IFNγ Bovigam® a été autorisé à titre expérimental en Dordogne, d’une part pour une utilisation en série après l’IDS (Ryan T.J et al., 2000), c’est-à-dire pour confirmer ou infirmer rapidement les résultats non-négatifs en IDS et ainsi, favoriser les déclarations de réactions non-négatives en IDS et, d’autre part pour un emploi en parallèle à l’IDS lors d’enquêtes épidémiologiques.  Le test Bovigam® est basé seulement sur des PPDs, c’est-à-dire sur la comparaison des réponses aux antigènes PPDB et PPDA et la comparaison des réponses aux PPDB et PBS (noté N). Néanmoins, cette seconde comparaison (DOPPDB–DON) n’a jamais été utilisée (comme publiée par Vordermeier H.M. et Ewer K. (2006a), Coad M. et al. (2008)) car, d’une part, selon Ryan T.J. et al. (2000), les valeurs de sensibilité et de spécificité sont inchangées sans tenir compte de ce critère et d’autre part, une valeur-seuil de validité de la qualité d’un échantillon sanguin stimulé par du PBS a été incluse : DON < 0,3 (critère utilisé par Coad et al., 2008) (Cf. § II.2.2., page 125 et Annexe X). Le critère DOPPDB–DON > 0,1 a été toutefois vérifié pour les différentes études relatives à l’utilisation du test en Dordogne (Cf. § IV., page 132) et nous avons obtenu les mêmes résultats qu’en l’absence de ce critère (résultats non présentés dans ce manuscrit).

Afin d’améliorer la spécificité du test Bovigam® en particulier dans les populations d’IDS non-négatives et de minimiser ainsi le taux de faux positifs, les antigènes spécifiques ESAT6 et CFP10 (protéines recombinantes) ont été ajoutés initialement séparément (campagne de dépistage de la Tb 2006-2007), puis, en mélange (campagnes de prophylaxie suivantes). De même, comme l’impose le guide AFNOR ELISA NF U 47-019 (AFNOR, 2007), un plasma de référence ou traceur (externe au kit) a été ajouté comme contrôle supplémentaire de l’ELISA. Il s’agit d’un mélange de plasmas de bovins ayant fourni des résultats fortement positifs au test IFNγ, dilué de manière à obtenir des résultats en unité DO assez faibles et suffisamment constants (DOTraceur–DOTN de 0,5, situé dans la zone de linéarité du graphique représentant la valeur de DO en fonction de la concentration en IFNγ (graphique présenté en Annexe XI (Figure A)) pour permettre de vérifier la reproductibilité des séries d’analyses réalisées par le laboratoire et entre les laboratoires utilisant ce même traceur (Cf. Figure II.1.2, page 127). Enfin, la stimulation cellulaire a été effectuée en micro-méthode à partir de 2008 en raison de l’augmentation du volume total de sang requis pour l’analyse de l’échantillon, augmentation résultant de l’ajout du PWM et des protéines recombinantes et de la réalisation de l’analyse des échantillons en double. Ainsi, les volumes de la stimulation cellulaire (sang et Ag (ou PBS ou PWM)) par puits ont été réduits tout en conservant les mêmes concentrations puisque selon Schiller I. et ses collaborateurs (2009), les résultats obtenus avec les deux méthodes (méthode décrite dans la notice Bovigam® et micro-méthode) sont similaires.

Ainsi, comme chaque échantillon est analysé en double (Coad M. et al., 2007), l’analyse d’un échantillon requiert 10 puits d’une plaque. Ensuite, nous suivons le même protocole que celui exposé dans la macro-méthode (homogénéisation, incubation sous agitation et centrifugation de la plaque, puis transfert des plasmas surnageants sur une autre plaque). Toutefois, comme chaque échantillon de sang est analysé en double, deux plasmas surnageants par échantillon sont alors obtenus et mélangés dans la plaque de transfert. 2007-2008), selon le mode opératoire du kit Bovigam® (Cf. Annexe VII). Compte tenu de la similitude entre micro- et macro-méthodes, les résultats ont été regroupés en négligeant le biais éventuellement induit par ce regroupement. Concernant les R (ESAT6 et CFP10) testés séparément, comme tous les résultats positifs étaient positifs pour les deux Ag et tous les résultats négatifs étaient négatifs pour les deux Ag, alors les résultats des R testés .