POUR L’ETUDE PAR aCGH 244K et 2x400K

 Patients atteints d’une t-LAM A partir d’une analyse cytogénétique par caryotype et/ou FISH (sur moelle osseuse ou sur du sang), une soixantaine de patients porteurs d’une leucémie secondaire dont l’envahissement médullaire ou la blastose sanguine était ≥ 60%, ont été enregistrés dans le laboratoire de cytogénétique de l’Institut Gustave Roussy entre 1995 et 2006. Ces patients n’étaient pas traités pour leur leucémie au moment du prélèvement. Le Centre de Ressource Biologique (CRB) de l’IGR avait à disposition 30 échantillons congelés dans l’azote liquide.

Les tableaux 6 et 7 résument les caractéristiques de ces leucémies ainsi que leurs résultats cytogénétiques et quelques cas de myélodysplasies induites. On compte dans la population pour l’étude en 244K, 8 cancers du sein, 7 lymphomes (non hodgkiniens et hodgkiniens), 3 cancers ovariens et 12 autres types de cancer (prostatique, endométrial, vésical, sarcomateux, de la sphère ORL et un myélome). La deuxième série pour l’étude en 2x400K apporte 6 nouveaux cas de t-LAM. On note un cas (tjal) présentant une seconde t-LAM.

Patients atteints d’une p-LAM

Trente six p-LAM ont été choisies et étudiées en 244K. La deuxième série pour l’analyse en 2x400K comprend 13 sujets. Leurs caractéristiques sont rapportées dans les tableaux 8 et 9. I

Description des étapes depuis la décongélation jusqu’à l’utilisation des puces Agilent

Chacune de ces étapes est résumée dans l’article de Itzhar N. et al, 2011 (voir la rubrique Annexe) 

Culture des fibroblastes

Cette étape a été choisie pour obtenir de l’ADN constitutionnel, la plupart des patients atteints de leucémie au moment de ce travail étant déjà (malheureusement) décédés, l’obtention d’un prélèvement de tissu normal de référence était exclue. Lorsque le nombre de cellules est ≥ 6.106 /ml, 1/3 de la solution est prélevée pour une mise en culture. Les 2/3 restants sont réservés pour l’extraction de l’ADN. Le milieu de culture initial comprend 20% de SVF dans du RPMI pour un volume total de 10ml.

Les flacons de cultures ventilés de 50 ml sont placés dans un incubateur à 37°C. Lorsque le nombre de cellules est ≤ 6.106 /ml, il n’y aura pas de culture car on privilégiera l’extraction d’ADN dans tous les cas. A J1, le milieu est changé afin de retirer un maximum de cellules blastiques en suspension. La composition du nouveau milieu comprend 10% de SVF dans du RPMI pour 10ml de volume total. La même opération est pratiquée entre J7 et J9 puis entre J14 et J16 et enfin aux alentours de J21.

À chaque fois les flacons sont replacés à 37°C. Chaque flacon est observé au microscope inversé afin de repérer les plages de cellules adhérentes dont l’aspect morphologique ressemble à des fibroblastes. Bien que ce paragraphe fasse partie du chapitre résultat, il est nécessaire, dès à présent de préciser que la culture des fibroblastes médullaires des t-LAM a échoué excluant l’extraction d’ADN constitutionnel des malades à partir de la moelle congelée. L’ADN témoin de référence, pour l’ensemble de la technique d’aCGH, est un ADN humain commercial, poolé (Proméga® ).