Phospholipides et liposomes

 Produits

Solvants, tampons

Du tetrahydrofurane a été utilisé pour solubiliser la deutéroporphyrine. Il a été distillé sur hydroquinone et l’absence de peroxydes a été contrôlée avant utilisation. La plupart des expériences de physico-chimie ont été effectuées à pH 7,4 dans du tampon phosphate salin (PBS, Na2HPO4/KH2PO4, phosphate total 9,57×10-3 M, NaCl 0,15 M et KCl 2,68×10-3 M), hormis celles visant à déterminer le rôle du pH. Celui-ci a alors été ajusté à des valeurs comprises entre 2 et 9,5. Les incubations des cellules ont été faites dans du tampon Hanks Hepès (HBBS, CaCl2/2H2O 0,185 gL-1 ; KCl 0,4 gL-1 ; KH2PO4 0,6 gL-1 ; MgCl2 6H2O 0,1 gL-1 ; MgSO4 7H2O 0,1 gL-1 ; NaCl 8 gL-1 ; NaHCO3 0,35 gL-1 ; Na2HPO4 0,048 gL-1 ; glucose 1 gL-1 ; Hepès 5‰ ; pH 7,4). 

Porphyrine et phtalocyanine

La deuteroporphyrine, dont la structure est donnée figure 1.1 (masse molaire 512 Da), a été préparée selon le protocole décrit précédemment [13]. Sa pureté, déterminée par HPLC, est supérieure à 99%. Une solution stock (10-3 M) a été préparée dans du tétrahydrofurane distillé et conservée à -18°C. Les solutions expérimentales ont été obtenues en évaporant un aliquot de la solution stock de façon à faire un film sur la paroi du récipient. Ce film a ensuite été dissout dans du PBS. Ces solutions ont été employées sans tarder et ont été fréquemment renouvelées afin de minimiser les phénomènes dus à l’agrégation de la porphyrine et à son adsorption sur le verre.

De plus, afin d’éviter tout photoblanchiment, les solutions de porphyrine ont été manipulées à l’obscurité. La phtalocyanine d’aluminium disulfonée (AlPcS2, masse molaire 779 Da, voir figure 1.6) a été préparée par l’équipe de D. Phillips [109, 110]. L’isomère cis a été isolé par HPLC en phase reverse. Les solutions stock sont préparées dans de l’eau bidistillée et conservées à -18°C. Les concentrations sont déterminées par absorption, le coefficient d’extinction molaire à 672 nm étant de 1,15×105 M-1 cm -1. 

Lipoprotéines

Les lipoprotéines de basse densité (LDL, masse molaire de l’apoprotéine 500 000 Da) humaines ont été achetées chez Calbiochem (San Diego, CA, Etats-Unis), ou ont été préparées par ultracentrifugation séquentielle [111] au laboratoire de biochimie de l’hôpital Nord d’Amiens. Les LDL commerciaux étaient conditionnés dans une solution aqueuse à 0,15 mM de NaCl à pH 7,4 additionnée de 0,01% d’EDTA. Les teneurs en protéines des solutions de LDL préparées par le laboratoire de biochimie d’Amiens ont été déterminées par la méthode de Lowry comme décrit par ailleurs [112].

L’intégrité des LDL après stockage et après mélange dans l’appareil de stopped-flow a été évaluée par électrophorèse SDS-page sur gel d’acrylamide (7,5%) et par électrophorèse en conditions natives sur gel d’agarose Tris-Glycine (agarose de 1%, tampon 25 mM de Tris et 192 mM de glycine, pH 8,4) [113]. Stockées à 4°C, les solutions stock se sont avérées stables pendant environ un mois.

Albumine

L’albumine de sérum humain (HSA, masse molaire 68 000 g/mol) débarrassée de toute contamination d’acides gras a été achetée chez Sigma (Saint Louis, Missouri, Etats-Unis), et stocké à 4°C. A 390 nm, son coefficient d’extinction molaire est d’environ 700 M-1 cm -1. Le lipide utilisé pour la préparation des liposomes est la dioleoylphosphatidylcholine (C18 :1, masse molaire 786 Da, obtenu chez Avanti Polar-Lipids). Dans sa forme commerciale, ce produit est en solution dans du chloroforme.

De petites vésicules lipidiques unilamellaires (SUV) ont été préparées par extrusion dans des solutions salines (0,15 M) tamponnées à différents pH grâce à 20 mM de phosphate, à partir de cette solution commerciale. Le chloroforme a été évaporé sous argon, le film ainsi obtenu est soigneusement séché. Du tampon phosphate a été ajouté, puis les lipides dispersés grâce à un vortex. A l’aide d’un appareil à extrusion (Lipex Biomembranes, Vancouver, CA), la suspension de liposome ainsi obtenue a été passée sous pression 8 à 10 fois au travers de deux membranes filtrantes de polycarbonate (Poretics, Livermare, CA) superposées dont les pores étaient de 50 nm. Pendant cette opération, la température doit être maintenue au dessus de la température de transition Tc [114]. En l’occurrence, l’appareil a été thermostaté à 25°C. Le diamètre des liposomes ainsi obtenus, déterminé par diffusion quasiélastique [115] de la lumière, est d’environ 75 nm, et la déviation standard sur ce diamètre est d’environ 20 nm.