Peroxydase d'origine végétale

L’AIL

L’ail cultivé a pour nom latin Allium sativum. C’est une plante herbacée, bulbeuse, vivace et à nombreuses petites fleures blanches linéaires, engainantes et formant une inflorescence en ombelle. Le bulbe mère repose sur une structure plate appelée plateau d’où partent les racines. Il est entouré de cinq à dix petits bulbes secondaires (caïeux), couramment désignés sous le terme de gousses. L’ensemble (bulbe et caïeux), est enveloppé d’une fine pellicule de couleur blanche ou rose selon les espèces. De la plante entière, émane une forte odeur piquante.
La reproduction de Allium sativum (As) est strictement végétative et ceci, à partir d’une gousse. Au printemps, le bulbe donne naissance à une mince tige cylindrique d’environ 30 cm de hauteur, engainée par de longues feuilles étroites.
L’ail est cultivé dans le monde entier et on l’utilise plutôt comme condiment pour sa saveur et son odeur piquante. Il est apprécié pour ses multiples propriétés médicinales.

EFFETS MEDICINAUX DES PRINCIPES ACTIFS

Plusieurs auteurs (environ 7000 travaux publiés) se sont intéressés à l’étude des substances bioactives de cette plante et leur mode d’emploi. En raison de l’ampleur exceptionnelle de ce corpus d’études, on se limite à quelques notes bibliographiques.
EFFETS ANTIOXYDANTS : As est riche en matières actives anti oxydantes incluant les composés sulfurés, les flavonoïdes et les phénols capables de piéger les radicaux libres. Il contient également du sélénium indispensable à la glutathion peroxydase (Pédraza et al., 2005). L’allicine est capable d’inhiber la formation du H2O2 par le système xanthine /xanthine oxydase, probablement par un mécanisme d’échange des groupements thiol (Chung, 2006). As particulièrement cru, stimule la libération des enzymes anti oxydantes telles que la superoxyde dismutase (SOD), la catalase (CAT) et la glutathion peroxydase (GPX) (Numagami et Ohnishi, 2001 ; Hamlaoui et al., 2009). Cette propriété est incontestable dans la réduction des peroxydes lipidiques au niveau du cœur, du foie et des reins (Banerjee et al., 2001 et 2002), la diminution du risque des cancers induits chimiquement ou par irradiation (Borek, 1997), ainsi que dans la prévention des lésions induites par les ROS au niveau de l’ADN, des lipides et des protéines (Gutteridge, 1993).
L’administration concomitante par voie cutanée pendant 4 jours du diallyl disulfure à raison de 50 mg /kg/ j avec la gentamycine à raison de 70 mg /kg/j, prévient la diminution des enzymes anti oxydantes (Pédraza et al., 2000).
EFFETS ANTI-INFECTIEUX : Les propriétés anti bactériales, anti microbiennes et anti septiques de l’ail datent bien avant le début de l’histoire humaine (Choi et al., 2007).
En 1999, on dénombrait environ 250 études sur les propriétés antibactériennes et antifongiques de As (Moore and Atkins, 1997) Parmi ces études, 27 essais ont été pratiqués sur des humains souffrant de pneumonie, de gingivite, de gastroentérite, de dyspepsie, et d’autres infections du tube digestif. D’autre part, 30 études ont porté sur l’activité antivirale de l’ail dont 23 ont été réalisées in vitro et sur des animaux, et 7 sur des humains, notamment contre les virus du rhume et de la grippe (Josling, 2001). Son effet antibactérien est attribué à sa capacité de réduire la teneur lipidique au niveau des membranes bactériennes ce qui provoque leur effondrement (Sohn et al., 2009). Son action antifongique est souscrite en application contre les mycoses de la peau (Ledezma et al., 2000). Son influence au niveau pulmonaire, s’exerce aussi bien dans le rhume banal et la coqueluche que dans l’emphysème, les bronchites chroniques et les pneumopathies d’origine infectieuse. Son essence, rapidement diffusée par les bronches (d’où l’halène alliacée des mangeurs d’ail), agit en même temps comme antispasmodique en calmant la toux, comme antiseptique et comme modificateur des sécrétions (Lawsan, 1998).
As est aussi efficace contre les insectes (Amankar et Reaves, 1970) et il représente avec l’absinthe, le vermifuge traditionnel très actif contre les oxyures, les ascarides et le ténia (Amankar et Banerjee, 1971). En usage externe, le suc dilué étant un excellent désinfectant des plaies et il est appliqué en compresses ou en pommade sur le furoncle.

LES ANTIOXYDANTS NON ENZYMATIQUES

Ces substances sont pour la grande partie, apportées par les aliments particulièrement, les fruits et légumes. Elles sont également utilisés comme additifs par l’industrie agro-alimentaire, pharmaceutique et cosmétique. Ce sont pour la plupart, des composés phénoliques lesquels, sont présents dans toutes les parties des plantes supérieures (Galati et O’Brien, 2004). On cite aussi les vitamines A (β-caroténoide), E (α-tocophérol) et C, le sélénium, les alcaloïdes, le zinc et les phitates qui existent en plus faible quantité. D’autres composés endogènes jouent un rôle sans doute important, il s’agit du glutathion réduit, des métallothionéines, de l’ubiquinone (coenzyme Q10) sous sa forme réduite, de l’acide lipoïdique et des polyamines.
La plupart des composés biologiques réagissent avec le radical hydroxyle, cependant, il conviendra de réserver le terme ‘antioxydants’ à des composés dont la teneur dans les tissus diminue lors d’un stress oxydant in vivo et qui ne donnent pas de dérivés toxiques. Par extrapolation, certains auteurs ont appelé antioxydants et élaboré des théories extrémistes pour des composés comme l’acide urique, la mélatonine, la bilirubine, l’albumine, voir le glucose ou les acides gras polyinsaturés alors que ces composés deviennent toxiques après oxydation et n’ont aucun caractère protecteur pour l’organisme. A titre d’exemple, le radical formé par le glucose participe fortement au phénomène pathogène de glycosylation des protéines .
Les composés naturels aux propriétés antioxydantes, sont également étudiés dans le but de développer de nouvelles structures modèles pour la mise au point de médicaments thérapeutiques et/ou protecteurs. Ces derniers, représentent une alternative à l’utilisation par exemple, du butylhydroxy-toluène (BHT) et le butylhydroxy-anisol (BHA) qui sont des antioxydants synthétiques (Potterat, 1997).

LES METALLOPROTEINES

Les métalloprotéines sont des protéines qui renferment dans leur structure des métaux. Ces derniers dans les cas les plus fréquents du fer, du cuivre, du zinc.
Les coordinances métalliques peuvent consolider la structure de la protéine autour d’un ion métallique. Les caractéristiques fondamentales sont les suivantes :
Les liaisons s’établissent à l’aide d’atomes appartenant à la protéine, détenteurs d’au moins un doublet électronique libre dans sa couche externe: O, N et S ; Les orbitales du métal imposent le nombre, la direction et la longueur de ces liaisons.
La combinaison protéine–métal forme ce qu’on appelle un chélate, obéissant à des contraintes relativement rigides. Le métal impose ses propres paramètres à la protéine et participe à l’établissement de la structure de celle-ci. Dans certaines enzymes, tel le cas des peroxydases, le métal intervient directement dans le mécanisme catalytique, et sa présence est donc indispensable à l’activité.

LES PEROXYDASES

NOMENCLATURE (EC) : La nomenclature EC (EC est le sigle de ‘Enzyme commission’) est une classification numérique des enzymes, basée sur la réaction chimique qu’elles catalysent. La première version de cette classification fut publiée en 1961 et elle est régulièrement remise à jour par l’Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (IUBMB).
Le code enzymatique consiste en les lettres majuscules EC, suivies de quatre nombres séparés par des points. Chacun de ces nombres représente une étape dans la précision de classification de l’enzyme. Le premier nombre variant de 1 à 6, indique le type de réaction catalysée : 1. Oxydoréductases (EC. 1) ; 2. Transférases (EC. 2) ; 3. Hydrolases (EC. 3) ; 4. Lyases (EC. 4) ; 5. Isomérases (EC. 5) ; 6. Ligases ou synthétases (EC. 6). Le second nombre indique le substrat général impliqué dans la réaction, le troisième, le substrat spécifique impliqué et le quatrième, le numéro de série de l’enzyme.
Par exemple, la peroxydase a pour code EC : 1.11.1.7 qui est construit comme suit : 1 signifie une oxydoréductase ; 1.11 : regroupe les oxydoréductases qui agissent sur les peroxydes comme accepteurs d’électrons ; 1.11.1 : implique celles qui utilisent H2O2 comme peroxyde ; 1.11.1.7 : indique précisément une peroxydase.

LA LIGNINE

On ne s’accorde toujours pas sur une définition unique et précise de la lignine du fait de sa grande variabilité et cela au sein même d’une espèce donnée, car sa formation dépend de l’environnement physico-chimique dans lequel le végétal croît. Il serait donc préférable de parler des lignines. La composition en monomères de lignines correspond aux trois unités, p-hydroxyphényle [H], guaïacyle [G] et syringyle [S]. Généralement chez les espèces monocotylédones, les monomères les plus abondants au niveau de l’hypoderme et l’endoderme des parois cellulaires et du xylème des vaisseaux, sont les unités [G] et [S]. Cependant, la contribution des unités [H] a été montrée au niveau du tissu hypodermique de quelques plantes comme l’oignon et l’ail, témoignant ainsi d’une lignine trop condensée. En tenant compte du fait que ce tissu est en contact direct avec la rhizosphère, cette condensation de lignine pourrait être interprétée comme une adaptation fonctionnelle de l’hypoderme à une protection contre les organismes pathogènes. A titre d’exemple, la lignine des conifères contient essentiellement les noyaux aromatiques de l’aldéhyde coniférylique. La lignine des arbres feuillus est beaucoup plus riche en noyaux aromatiques doublement méthoxylés comme dans le cas de l’aldéhyde sinapylique. D’autres monomères existent également dans les lignines.

Table des matières

INTRODUCTION
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. L’AIL (Allium sativum)
1. Présentation
2. Classification et diversité
3. Historique : vertus thérapeutiques
4. Les constituants chimiques
4.1 Les produits naturels
4.2 Les produits de transformation
4.3 Les saponines
5. Effets médicinaux des principes actifs
5.1 Effets antioxydants
5.2 Effets anti-infectieux
5.3 Protection cardiovasculaire
5.4 Prévention du cancer
5.5 Autres effets désirables
5.6 Effets indésirables chez l’homme
II. LES ANTIOXYDANTS NATURELS
1. Les antioxydants enzymatiques
1.1 Les glutathion peroxydases
1.2 Les superoxydes dismutases
1.3 La catalase
1.4 Les thiorédoxines
1.5 Les peroxyrédoxines
1.6 La hème oxydase
2. Les antioxydants non enzymatiques
2.1 Les composés phénoliques
2.1.1 Généralités
2.1.1 Classification
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
III. LES METALLOPROTEINES
1. Généralités
2. Les protéines à fer
a) Protéines héminiques
b) Protéines non héminiques
c) Protéines de transport ou de stockage du fer
3. Structure des hémoprotéines
3.1 Les coenzymes hématiniques
IV. LES PEROXYDASES
1. Nomenclature (EC)
2. Historique
3. Définition
4. Sources et classification
5. Peroxydases des plantes
5.1 Polymorphisme
5.2 Spécificité de substrat
5.3 Aspects physiologiques
5.4 Localisation tissulaire et subcellulaire
5.5 Structure et site actif
5.5.1 Structure
5.5.2 Site actif et acides aminés impliqués dans la catalyse.
5.6 Mécanismes d’action
5.6.1 En présence de substrat réducteur
5.6.2 En absence de substrat réducteur
6. La lignine
6.1 Généralités
6.2 Biosynthèse
6.3 Dégradation peroxydasique
7. Interactions des peroxydases avec O2
8. Brunissement enzymatique
9. Les haloperoxydases : aspects physiologiques
10. Domaines d’utilisation des peroxydases
V. BIOCAPTEURS A PEROXYDASES
1. Applications
1.1 Domaine biologique
1.2 Domaine agro alimentaire
1.3 Domaine environnementale
OBJECTIFS DU TRAVAIL
MATÉRIEL ET MÉTHODES
A. MATERIEL
1. Matériel biologique
2. Enzymes et substrats
3. Solutions stocks des substrats
4. Supports d’immobilisation et gels
5. Autre matériel
B. METHODES
I. PREMIERE ETUDE
1. Dosage de l’activité peroxydase
2. Dosage des protéines
a) Avec le gaïacol
b) Avec l’o-dianisidine
3. Purification enzymatique
3.1 Extraction des protéines
3.2 Concentration des protéines
a) Concentration par ultrafiltration
b) Concentration par sulfate d’ammonium
3.3 Chromatographie par filtration sur gel
3.4 Chromatographie par échange de cations
4. Techniques d’électrophorése
4.1 PAGE en conditions natives
4.1.1 PAGE cathodique
4.1.2 PAGE anodique
4.1.3 Révélation de l’activité peroxydase sur gel
4.2 PAGE en conditions dénaturantes
4.2.1 SDS-PAGE
4.2.2 Électrophorèse de focalisation
4.2.3 Révélation des protéines sur gel
5. Caractérisation biochimique de POX2
5.1 Optimisation des paramètres de dosage
5.2 Etude de la stabilité
a) Effet du pH
b) Effet de la température
c) Effet du stockage
d) Effet des solvants et éléments cationiques
5.3 Etude cinétique
6. Immobilisation par liaison covalente
6.1 Stabilité de l’enzyme immobilisée
a) Stabilité à la température
b) Stabilité au stockage
7. Application dans la détection de H2O2
II. DEUXIEME ETUDE
1. Purification enzymatique
1.1Préparation de l’extrait brut
a) Extraction de la fraction soluble
b) Extraction de la fraction liée
1.2 Concentration des protéines
1.3 Dialyse
1.4 Clarification : extraction des lipides
1.5 Chromatographie par échange de cations
2. Techniques d’électrophorése
2.1 PAGE en conditions natives
2.1.1 PAGE cathodique
2.1.2 IEF cathodique
2.2 PAGE en conditions dénaturantes : SDS-PAGE
3. Détermination du pH d’activité
4. Dosage de l’activité peroxydase
a) Avec le 4MN
b) Avec le p-AC, la quercétine /quercitrine
5. Oxydation des composés phénoliques de l’ail
5.1 Etude spéctrale
5.2 Etude cinétique
RESULTATS ET DISCUSSIONS
PREMIERE ETUDE
CHAP I. PURIFICATION ET CARACTERISATION DE POX2
1. Profil des iso-peroxydases du bulbe d’ail
2. Purification de la peroxydase POX2
3. Caractèrisation biochimique
3.1 Poids moléculaire
3.2 pH isoélectrique
3.3 pH et température d’activité
3.4 Constantes cinétiques (Kmgaϊacol et KmH2O2)
CHAP II. STABILITE, IMMOBILISATION ET APPLICATION DE POX2
1. Etude de la stabilité
1.1 Effet de la température
1.2 Effet du pH
1.3 Effet des inhibiteurs
2. Immobilisation
2.1 Stabilité et cycles de réutilisation
3. Application de l’enzyme dans la détection de H2O2
DEUXIEME ETUDE
CHAP III. PURIFICATION ET CARACTERISATION DE Prx
1. profil iso-peroxidasique de l’extrait du bulbe
2. Purification d’une activité peroxidase
3. Techniques d’électrophorése
3.1 IEF
3.2 SDS-PAGE
3.3 PAGE native cathodique
CHAP IV. OXYDATION DES SUBSTRATS PHYSIOLOGIQUES
1. Oxydation des flavonols aglycones et leurs glycosides
2. Oxydation des structures p-hydroxycinnamiques
3. Oxydation des structures sinnapyliques
4. Caractérisation cinétique
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXE