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PARCOURS DANS LA RECHERCHE SUR LES PRODUITS NATURELS D’ORIGINE VEGETALE
De la préparation du DEA à la réalisation du Doctorat
L’année 1997 marquait mon premier pas dans la recherche lorsque j’ai fait mes travaux de recherche dans le cadre de la préparation de mon Mémoire de Diplôme d’Études Approfondies (DEA). J’ai réalisé ces travaux au Laboratoire de Pharmacologie Expérimentale de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA) sous la direction scientifique du Professeur RANDRIANTSOA Adolphe. Durant cette période, il m’a été confié l’étude du profil pharmacologique d’une plante médicinale, codée AR 96, utilisée dans la médecine traditionnelle pour traiter l’asthme. L’approche pharmacognosie était donc adoptée. L’étude comportait des tests in vitro réalisés sur organes isolés et des tests de bronchospasme provoqué in vivo. Les tests in vitro étaient utilisés pour établir le mécanisme d’action pharmacologique de l’extrait de la plante, et les tests in vivo ont permis de vérifier l’utilisation traditionnelle de la plante. Les résultats de ces travaux ont été présentés lors de mon Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de DEA qui a été sanctionné par la mention Bien.
Aussitôt le diplôme de DEA obtenu, j’ai été recruté comme chercheur assistant au Laboratoire de Chimie et de Cancérologie Expérimentale de l’IMRA. J’ai intégré l’équipe du Professeur RASOANAIVO Philippe qui travaillait sur les plantes dans le but de trouver des molécules ayant un effet potentialisateur de la chloroquine ; les molécules cibles étant des alcaloïdes ; les tests ont été réalisés sur des souches de Plasmodium falciparum sensibles et résistantes à la chloroquine. Dans ce thème de projet, l’approche « reverse pharmacognosy » était adoptée. En effet, nous avons testé systématiquement les extraits de plantes appartenant à des familles botaniques à alcaloïdes (Menispermaceae, Apocynaceae, Loganiaceae, etc.).
Après avoir passé 4 mois dans ce projet sur le paludisme, j’ai rejoint l’équipe du Professeur Kurt HOSTETTMANN de l’Institut de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Lausanne pour effectuer un stage post-gradé, et ce grâce à la bourse de coopération offerte par la Confédération Helvétique. Puis, j’ai été recruté comme assistant à l’Université de Lausanne ; ce statut m’a permis de réaliser mes travaux de Thèse de Doctorat sous la direction du même Professeur. Mon sujet de Thèse était la recherche de composés végétaux à activité antifongique. Depuis, mes travaux de recherche sur les plantes s’intéressaient à leur composition chimique plutôt qu’à leur profil pharmacologique. Le fractionnement bio-guidé était alors adopté jusqu’à la purification des composés actifs. Les tests bioautographiques directes sur plaque en utilisant Candida albicans et Cladosporium cucumerinum comme souches fongiques ont été utilisés ; cette technique se révèle être facile à mettre en œuvre et moins coûteuse. Les travaux de fractionnement et de purification ont été réalisés au moyen de différentes techniques chromatographiques simples ou couplées en utilisant des phases normale et inverse ou des tamis moléculaires (CCM, CC, CLMP, CLHP préparative, CLHP analytique). L’identification des molécules isolées a été faite au moyen des analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN), spectrométrie de masse (SM), dichroïsme circulaire (CD), spectrophotométrie UV-Vis, des réactions chimiques, etc. J’ai travaillé sur 02 plantes endémiques malgaches, Ravensara crassifolia (Lauraceae) et Helichrysum faradifani (Asteraceae) à partir desquelles, j’ai isolé et identifié 14 molécules parmi lesquelles, 7 sont de structure nouvelle et 5 actives sur C. albicans et C. cucumerinum.
SYNTHÈSE DES RÉSULTATS DES TRAVAUX SUR LE CONTRÔLE DE QUALITÉ DES PLANTES
En tant que scientifique et acteur dans la santé publique, l’on se demande «comment pourraiton assurer la qualité d’une plante ou d’une préparation à base végétale si on ne dispose pas d’un moyen technique fiable pour effectuer un contrôle ? Comment convaincre les consommateurs que telle préparation médicinale, sensée guérir leurs maux est de bonne qualité ? » Le contrôle qualité de la plante est nécessaire et obligatoire dès lors que celle-ci est utilisée à visée médicale, qu’elle soit présentée comme matière première ou qu’elle soit déjà transformée en produit fini. Le contrôle qualité est réalisé dans le but de garantir la qualité et l’efficacité du produit et aussi la sécurité d’emploi, il permet d’éviter et de détecter la non-conformité, les fraudes et falsifications. Dans le dossier de demande de AMM, le demandeur est tenu de donner le moyen technique permettant de contrôler la qualité de son produit. Ces méthodes de contrôle de qualité peuvent être de simples méthodes d’identification et/ou des méthodes de quantification du(des) principe(s) actif(s).
La mise en œuvre d’une méthode d’identification dépend de la nature de l’échantillon à contrôler :
● S’il s’agit d’une plante entière ou de son organe intact, l’identification peut être aisée en utilisant les caractères botaniques macroscopiques et organoleptiques ; en cas de doute, l’identification peut être confirmée par l’analyse microscopique des caractères cytologiques et histologiques selon la monographie de la plante. En plus de l’identification, la qualité du produit peut être évaluée par la détermination du taux des éléments étrangers, par la recherche des contaminants comme les résidus phytosanitaires (pesticides, herbicides, fongicides), les métaux lourds, les éventuelles souches microbiennes potentiellement pathogènes.
● Si le produit se présente déjà sous forme de poudre d’une seule plante, l’identification peut être réalisée selon ses caractères microscopiques. Mais il est préférable de confirmer ces analyses par des analyses chimiques.
● Dans le cas où le produit est un mélange de poudres de plantes, l’identification n’est possible qu’avec des méthodes d’identification chimiques. Il en est de même pour les extraits de plantes. Généralement, ces méthodes d’identification chimique sont des réactions chimiques spécifiques aux composés cibles ; ces composés peuvent être le(s) principe(s) actif(s) ou le(s) traceur(s) chimique(s). La qualité des extraits peut être évaluée en faisant la détermination des résidus de solvants, du taux d’humidité, du taux de métaux lourds présents, de l’analyse des caractères physico-chimiques (densité, pouvoir rotatoire, indice de réfraction) selon les recommandations de la Pharmacopée Européenne.
La mise en œuvre d’une méthode de quantification fait appel à des analyses instrumentales. Vu que les plantes sont des matrices complexes renfermant des milliers de composés différents, les méthodes couramment utilisées ont recours au couplage d’une méthode de séparation généralement chromatographique à une méthode de détection, le mode de détection utilisé étant varié (UV/Vis, SM, fluorescence, etc.). Le composé dosé peut être le(s) principe(s) actif(s) ou les contaminants comme les métaux lourds, les résidus phytosanitaires. La quantification de l’effet pharmacologique fait partie du contrôle de qualité des plantes et extraits de plantes. Dans ce type de méthode quantitative, on utilise les tests pharmacologiques, microbiologiques ou des réactions chimiques (exemple la réaction avec DPPH) pour évaluer la qualité de la plante ou de l’extrait testé.
Bref, le développement d’une méthode de contrôle de qualité fait appel à plusieurs compétences, botanique, chimie, pharmacologie, microbiologie, statistique, etc. Cette multidisciplinarité est nécessaire car le contrôle qualité est un acte technique délicat, tous les moyens doivent être mis en œuvre pour dissiper le moindre doute sur la qualité du produit testé . La conclusion sur la qualité du produit dépend de la fiabilité des résultats obtenus de ces méthodes.
Lorsqu’on fait le contrôle de qualité chimique de la plante, l’idéal est de travailler directement sur son(ses) principe(s) actif(s). La connaissance ce(s) composé(s) permet de faire l’identification, de déterminer la teneur en substances actives, et de quantifier l’activité pharmacologique de la plante. Dans notre approche, le contrôle qualité de plantes comprend l’isolement et la caractérisation du ou des principe(s) actif(s) s’il(s) n’est (sont) pas encore connu(s), et la mise au point et validation d’une méthode d’identification et de quantification une fois les composés cibles sont identifiés. Les plantes traitées dans ce chapitre sont utilisées dans la médecine traditionnelle malgache, à l’exception de Ravensara crassifolia.
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