Outils moléculaires utilisés dans l’étude des plaques d’agrégation

Conception de dérivés 2-aryl-benzothiazoles pour la reconnaissance d’agrégats du peptide amyloïde-β par diverses approches physico-chimiques

Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA.

Voies d’accès autour du motif benzothiazole benzothiazole benzothiazole. 

Rappels bibliographiques 

La production de dérivés de la ThT pour l’étude de la plaque amyloïde a conduit les chercheurs à développer différentes sources de voies d’accès aux motifs 2-aryl-BzT. Il existe un panel conséquent de réactions permettant d’accéder à ces motifs. L’accès aux 2-aryl-BzT peut se faire de deux principales manières : – Formation du BzT puis couplage avec la partie aryle en position 2. – Couplage des 2 dérivés aryles par la formation d’un cycle thiazole. La littérature étant très large, une liste non exhaustive de différentes réactions est présentée ici, ces réactions étant parmi les plus récurrentes. Différents réactifs sont utilisés, certains pouvant donner accès directement aux 2-aryl-BzT, d’autres seulement à des dérivés du BzT qui seront ensuite couplés à un cycle aryle.

 A partir d’aminothiophénol 

Le 2-aminothiophénol est le premier réactif utilisé pour la synthèse des BzT par la réaction d’Hofmann en 1887.[1] Le noyau BzT est obtenu par réaction avec le phénylisothiocyanate pour obtenir le 2-(Naminophényle)-BzT (Fig. 1). Figure 1. Formation de la 2-(N-aminophényle)-BzT par Hofmann et al. La réaction permet un accès facile aux noyaux BzT. Depuis, de nombreuses autres réactions à partir du 2-aminothiophénol ont été utilisées pour obtenir des noyaux BzT. Parmi celles-ci, on retrouve de manière très récurrente l’utilisation du benzaldéhyde permettant d’accéder aisément aux dérivés 2-aryl-BzT (Fig.2).[2-4] Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 46 Figure 2. Schéma simple de la synthèse des 2-aryle-BzT à partir de l’aminothiophénol.

 A partir de l’aniline

 A partir de l’aniline A partir de l’aniline La synthèse du noyau BzT à partir d’aniline a été pour la première fois utilisée en 1901 par Hugerschoff à partir d’arylthiourée avec l’utilisation du dibrome.[5, 6] L’arylthiourée peut être obtenue à partir de l’aniline par réaction avec le thiocyanate de sodium. L’aniline doit être substituée en position para pour éviter que le thiocyanate réagisse sur cette position.[7] Le dérivé thiourée peut ensuite réagir par substitution électrophile afin d’accéder au 2-aminobenzothiazole en présence du dibrome (Fig. 3A). Un avantage majeur de cette réaction est qu’il possible de pouvoir former la thiourée et le noyau BzT en « one-pot ».[8] Le noyau BzT peut également être obtenu à partir d’anilide converti, grâce au réactif de Lawesson, en thioacétanilide. Ce dernier, en présence de K3Fe2(CN)6 subit une cyclisation pour former le noyau BzT (Fig. 3B).[9] Figure 3. A : Synthèse de la 2-amino-BzT à partir de l’aniline. B : Synthèse du noyau BzT à partir d’acétanilide. Les anilines, ainsi que leur dérivé en para, constituent une grande famille de molécules, il est donc possible d’obtenir différents dérivés pour enrichir la diversité des 2-amino-BzT. 

 A partir du noyau thiazole

 A partir du noyau thiazole A partir du noyau thiazole De manière moins conventionnelle, il est possible d’accéder au motif BzT non pas en formant le cycle thiazole à partir d’un dérivé benzyle mais en formant le benzyle à partir du motif thiazole lors de réaction de Diels-Alder (Fig. 4).[10] Seulement, cette voie d’accès aux BzT reste difficile en raison de la moindre Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 47 disponibilité des thiazoles comparés à l’aniline par exemple, ce qui limite la diversité moléculaire qu’on peut obtenir par ce type de réaction. Figure 4. Synthèse des noyaux BzT par réaction de Diels-Alder. 

 Choix de la voie utilisée 

Comme énoncé en introduction de cette partie les motifs 2-aryl-BzT peuvent être obtenus soit en formant d’abord le noyau BzT avant couplage avec un aryle, soit en combinant un dérivé 2-thioaniline avec un dérivé benzaldéhyde pour former directement le motif 2-aryl-BzT. Dans le cadre de nos travaux, nous avons opté pour la voie de Hugerschoff avec les anilines qui permet de pouvoir effectuer des synthèses avec des quantités supérieures à la dizaine de grammes. Par ailleurs, cela permet d’effectuer les modifications souhaitées sur le motif BzT ou aryle avant leur couplage. La position para de l’aniline servant de pivot à toutes les fonctions ou dérivés possible des 2-aryl-BzT. I.2. Couplages C I.2. Couplages C .2. Couplages C-C entre les C entre les C entre les BzTet les dérivés aryles. et les dérivés aryles. et les dérivés aryles. Le couplage des cycles aromatiques est une technique largement utilisées pour accéder aux composés biaryles. Nous nous intéresserons ici à des exemples de couplages qui ont permis d’accéder aux 2-aryl-BzT. 

Couplage de Stille

Le couplage de Stille, découvert en 1978, met en jeu un dérivé halogéné et un dérivé d’étain : le ArSnBu3 (Fig.5).[11] La réaction de couplage est catalysée par le palladium. Le cycle se déroule en 3 étapes : i) addition oxydante du palladium dans la liaison C-X, ii) transmétallation avec l’aryltrialkylétain puis iii) élimination réductrice pour régénérer le catalyseur. Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 48 Figure 5. Cycle catalytique simplifié de la réaction de Stille. Cette réaction a été mise à contribution dans la synthèse de 2-aryl-BzT (Tableau 1) : Tableau 1. Exemples de couplage de Stille avec le motif BzT. Catalyseur Température (°C) Temps (h) Rendement (%) Références Cl -SnBu3 PdCl2(PPh3)2 120 20 86 [12] -SnBu3 -Br PdCl2(PPh3)2 120 20 56 [12] -SMe -SnBu3 PdCl(PPh3)2(CH2Ph)/ CuMeSaI 50 20 89 [13] I.2.b. Couplage Couplage CouplagedeMiyaura Miyaura Miyaura-Suzuki Le couplage de Miyaura-Suzuki (SMR : Suzuki-Miyaura Reaction) est l’une des méthodes les plus répandues dans l’obtention des espèces biaryliques depuis sa découverte en 1979.[14] La réaction de couplage utilise les complexes de Pd tout comme le couplage de Stille. La différence réside dans l’utilisation de dérivés d’acides ou d’esters boroniques au lieu de dérivés stanneux. Le cycle catalytique reste globalement le même celui du couplage de Stille (Fig. 5). Une illustration plus précise sera donnée lorsque cette réaction sera abordée au cours de la synthèse de la NMA (§III.1). La SMR requiert cependant l’utilisation d’une base. Une sélection de réactions de couplage avec le noyau BzT effectuées par SMR est donnée dans le Tableau 2 : Tableau 2. Résumé des conditions expérimentales de la SMR. Catalyseur Température (°C) Temps (h) Rendement (%) Références Br B(OH)2 Pd2(dba)3 100 6 40-72 [15] Br B(OH)2 Pd(PPh3)4 150 0,75 >90 [16] Br B(OH)2 Pd(OAc)2 100 5 84 [17] Cl B(OH)2 Pd(OAc)2 80 0,25 93 [18] Br B(pin)2 Pd(dppf)Cl2 80 1,5 94 [19] Cl B(OH)2 Pd(PPh3)4 X X X [20, 21] I.2.c. Couplage Couplage Couplagepar activation de la par activation de la par activation de laliaison C liaison C liaison C-H La dernière réaction de couplage se produit par l’activation de la liaison C-H (Fig. 6). Figure 6. Schéma simplifié de la réaction de couplages par la liaison C-H. Ce type de réaction est beaucoup plus récent dans la littérature que les réactions de couplage classique en raison des derniers développements sur l’activation des liaisons C-H peu réactives par rapport aux liaisons C-X. Cette réaction permet un couplage avec un grand nombre de dérivés (Tableau 3). Tableau 3. Résumé des conditions expérimentales des couplages de la liaison C-H. Catalyseur Additif Solvant Température (°C) Temps (h) Rendement (%) Références Y = -CH2-COOH Cu(OAc)2 X DMSO 

Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA

Voiesde synthèse privilégié de synthèse privilégié de synthèse privilégiéespour la synthèse de la NMA pour la synthèse de la NMA pour la synthèse de la NMA Parmi les voies de synthèses énoncées ci-dessus, nous avons privilégié une synthèse du noyau BzT à partir d’un dérivé d’aniline (Fragment A) beaucoup plus accessible que les dérivés thiazoles ou les dérivés aminothiophénols ce qui permet de le produire en grande quantité. Il est possible ensuite d’avoir accès aux dérivés 2-halogéno-BzT depuis le 2-amino-BzT par la réaction de Sandmeyer.[26] Dans ces travaux, nous avons opté pour une synthèse en 3 étapes principales : i) La formation d’un fragment A à partir de l’acide 4-aminobenzoïque (PABA). ii) La formation un fragment B porteur d’une méthylamine issu de la 4-bromoaniline. iii) Ces deux parties seront ensuite couplées par SMR pour former un motif C dont les fonctions en position 6 seront modifiées afin de synthétiser la molécule NMA souhaitée (Fig.7). Figure 7. Schéma des étapes-clés de synthèse de la NMA. II.Synthèse Synthèse Synthèse du fragment A du fragment A du fragment A II.1 Formation I.1 Formation I.1 Formation du cycle benzothiazole du cycle benzothiazole du cycle benzothiazole. La formation de l’acide 2-amino-1,3-benzothiazole-6-carboxylique s’effectue à partir du PABA par addition de thiocyanate d’ammonium (NH4SCN) et de dibrome (Br2) dans l’acide acétique (AcOH). Cette réaction décrite par Hugershoff en 1901 et 1903,[5, 6] est encore utilisée de nos jours.[8, 27-31] La synthèse se fait avec un bon rendement de 80% (Fig.8) et présente aussi l’avantage de pouvoir être conduite sur plusieurs de dizaines de grammes (jusqu’à 30 grammes au cours de ces travaux de thèse).Figure 8. Schéma de la réaction pour obtenir le produit 2. Le mécanisme de la réaction se décompose en deux étapes : i) addition de la fonction aniline sur le carbone du thiocyanate pour former le dérivé thiourée ; ii) substitution électrophile aromatique par le dérivé thiourée. Une prototropie conduit à l’aromaticité du cycle thiazole (Fig. 9). Figure 9. Mécanisme de la réaction d’Hugerschoff. 

Synthèse du composé composé composé

La synthèse de 3 se fait par estérification de Fischer du composé 2.[32, 33] Le produit 2 est solubilisé dans de l’éthanol auquel on ajoute une solution d’acide sulfurique dilué dans de l’éthanol au goutte-à-goutte à 0°C. Le milieu réactionnel est ensuite porté à reflux pour la nuit (Fig 10). Figure 10. Schéma de la réaction pour obtenir le composé 3. L’acide sulfurique est ajouté en excès afin de déplacer la réaction vers la formation de l’ester. Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 52 II.3.Iodation du composé Iodation du composé Iodation du composé 3. Le remplacement de l’amine en position 2 du composé 3 par l’iode se fait par la réaction de Sandmeyer (Fig. 11).[26] Cette réaction s’effectue via la production d’un composé diazonium depuis l’amine permettant l’introduction d’un halogène par addition sur le cycle [34] (sauf le fluor qui lui est introduit par réaction de Balz-Schiemann),[35] et libérant du diazote. Cette méthode a été adaptée maintes fois dans la littérature pour déplacer le diazonium avec des groupements nucléophiles autres que les halogènes comme des cyanures,[36] des hydroxyles [37] ou encore des pentafluoroethylthiols.[38] Dans notre cas, nous avons effectué cette réaction à partir du produit 3 solubilisé dans l’acétonitrile (ACN) auquel est ajouté l’acide paratoluène sulfonique (APTS), de l’iodure de potassium (KI) et de l’iodure de cuivre (CuI) en quantité catalytique (1 %). Le tert-butyle nitrite (tBuONO) est ensuite ajouté au goutte-à-goutte. Cette réaction s’effectue avec un rendement modéré de 60%. Figure 11. Schéma de la réaction pour obtenir le produit 4 avec sa structure cristallographique. Le mécanisme de cette réaction est en deux étapes : i) le nitrite réagit en milieu acide pour produire l’ion nitrosonium réagissant avec l’amine en position 2 du composé 3 pour former le diazonium. ii) En fonction de la présence ou non d’iodure de cuivre(I) (CuI) le mécanisme d’addition de l’iode sur le BzT diffère. Voie A : L’iodure s’additionne sur le carbone ce qui élimine le diazote pour former le produit 4 désiré. Voie B : La présence de CuI, par un mécanisme de transfert monoélectronique (SET : Single Electron Transfer), permet le départ du diazonium en générant un carbone radicalaire et la formation du diiodure de cuivre(II) (CuI2). Celui-ci en présence du carbone radicalaire, transfère l’iode radical pour régénérer le CuI et forme le produit désiré (Fig. 12). Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 53 N S N2 + EtOOC N S N2 + EtOOC I – Cu(I)I Cu(II)I2 N S I EtOOC N C • EtOOC S N S N EtOOC N • N2 SET Etape 2A : Etape 2B : N2 I – N S I EtOOC 4 O NO Etape 1 : H+ O + H N HO N O + O N S NH2 EtOOC N S N + EtOOC N O H H ~2H+ N S N EtOOC N O+ H H N S N + H2O EtOOC N 3 Figure 12. Mécanisme de la réaction de Sandmeyer. Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 54 L’ajout de Cu(I) améliore significativement le rendement réactionnel. Sans le Cu(I), le rendement ne dépasse pas les 25% alors que l’ajout de CuI permet d’atteindre les 60% (Tableau 4). Le rendement faible de la voie A suggère que le carbocation intermédiaire se dégrade ou réagit dans le milieu réactionnel. Tableau 4.Conditions expérimentales de la réaction du composé 3 vers le composé 4. Voie Réactif 1 Réactif 2 Réactif 3 Catalyseur Réactif 5 Solvant Durée (jrs) Rendement (%) A 3 APTS KI X tBuONO ACN 2 23% B 3 APTS KI CuI (10%) tBuONO ACN 3 47-60% Cette réaction peut ê également à la synthèse à l’échelle de plusieurs grammes, un rendement sur produit isolé de 60% a été obtenu à partir de 10 g de produit 2

Synthèse autour du fragment B 

Protection de la 4-bromoaniline bromoaniline bromoaniline

 La transformation de 1’ en 2’ (Fig. 13) s’est faite par 2 protocoles de synthèse différents : Figure 13. Schéma de la réaction de synthèse du composé 2’. Dans un premier temps nous avons effectué la réaction en milieu basique via l’utilisation de l’hydrure de sodium (NaH) dans le THF.[39-43] Cette voie consiste à augmenter le caractère nucléophile de la fonction amine en la déprotonant par l’ajout de NaH, une base forte. Cette déprotonation exacerbe le caractère base de Lewis de l’aniline puisque seul l’un des 2 doublets de l’amide est conjugué avec le noyau aromatique (Fig. 14). L’ajout de dicarbonate de di-tert-butyle (Boc2O) qui est alors attaqué par l’amidure libère du dioxyde de carbone (CO2) ainsi que le tert-butylate (tBuO- ) avec la formation de produit protégé. Chapitre II : Synthèse des dérivés 2-aryl-BzT et de la NMA 55 Figure 14. Mécanisme réactionnel de la protection au Boc avec l’utilisation du NaH. . Cette réaction se produit sans difficulté sur quelques grammes mais lors de l’augmentation d’échelle nous avons observé une chute du rendement (~92 % à 49 %). Une première stratégie a été de diviser les lots en plusieurs milieux réactionnels à l’aide d’un carrousel pour faire des synthèses en parallèle. Cependant la difficulté de contrôle des milieux réactionnels, en particulier l’usage de l’argon, avec le carrousel a orienté la synthèse vers une voie B plus simple à mettre en œuvre. Les travaux de Heydari et al.[44] rapportent des protections d’amine avec le Boc dans des solvants fluorés telles que l’hexafluoroisopropanol (HFIP) ou encore le trifluoroéthanol (TFE). La voie B, présentée ici, est adaptée de ces travaux. Cette réaction se produit simplement en ajoutant la 4-bromoaniline et le Boc2O dans le TFE et de laisser la réaction sous agitation. Le produit désiré précipite en solution, ce qui permet une purification aisée par filtration et lavage. Cela n’améliore pas le rendement par rapport à la voie A mais cela permet une économie de temps de traitement et également une augmentation d’échelle puisque cette réaction peut être effectuée sur des quantités de l’ordre de la dizaine de grammes (Tableau 5). Le filtrat peut être évaporé pour précipiter davantage le produit jusqu’au moment où le produit de départ précipite également. Cependant on augmente le risque d’obtenir un mélange. Une voie de synthèse encore plus simple existe, puisqu’elle ne nécessite pas de solvant. La réaction se fait sous vide afin d’éliminer le tBuOH, et le CO2 à mesure de leur formation. Cette réaction a été conduite avec 5 grammes de produit avec un rendement quantitatif.