Origine et développement de l’embryogenèse somatique

REGENERATION PAR EMBRYOGENESE SOMATIQUE DE Keraudrenia macrantha (Sterculiaceae), UNE ESPECE ENDEMIQUE MENACEE DU SITE MINIER D’AMBATOVY

SITE DE PRELEVEM ENT DES EXPLANTS

SITUATION GEOGRAPHIQUE

Le site d’exploitation minière d’Ambatovy est situé au cœur de l’une des régions particulièrement riches en e spèces, dans l’extrémit Sud du corrido r forester de l’Est (http://6 ; http ://7). Il s’étend sur 1800ha et se trouve à 25 km au Nord-Nord-Est de Moramanga. Ce site est local isé entre l longitude Est 48° 18’ 00’’ et la latitude Sud18° 49’ 0,12’’ (http:// 8) (carte1 en an nexe I).

CLIMAT

La forêtd’Ambatovy présente un bioclimat oriental humide avec un taux d’humidité relative annuelle moyenne d e 95% (http://9). La précipitation moyen ne annuelle est de 1400mm dont près de 70% des pluies annuelles tombent entre décemb re et mars (Dyn tec Corporation, 2006). Concerna nt la température, le mois le plus chaud est le mois de février tandis que le plus froid est le mois de juillet (http:// 9) (figure 1). La te mpérature moyenne annuelle du site d’exploitation minière d’Ambatovy est de 17°C (Dynatec Corporation, 2006). Les variations mensuelles de la précipitation et dela température du site d’Ambatovy sont en annexe II.

MATERIELVEGETAL

PLANTE MERE

La plante mère source d’explants utiliséeest Keraudrenia macrantha, (photo1). Les codes du pied mère et leurs coordonnées géographiques ainsi que leurs répartitions dans le site d’exploitation minière d’Ambatovy ont été mentionnés en annexe III.

Descrip tion morphologique

Keraudrenia macrantha est un arbuste hermaphrodite qui peut attein dre 5m de haut. Les feuilles sont simples, alternées et stipulées très longues atteignant 11,5cm de long et 22mm de large. Les rameaux sont cylin driques. L’inflorescence est en petites cymes composées de deux
à trois fleurs. Le fruit est une capsule déhiscente (Arènes, 1959). La fructification se déroule au mois de novembre jusqu’au mois de mars.

EXPLANTS

– Graines noires (photo2 ) issues des fruits mûrs de couleur vert jaunât re (photo 3), de 2 cm de diamètre ;
– Hypocotyles issues de s graines germéesin vitro ;
– Feuilles apparues après les feuillescotylédonaires de plantules.
RAZANADRASOA RAZANADRASOA
Photo 2 : Graines de Ke raudrenia
macrantha
Photo 3 : Fruits mûrs d e Keraudrenia
macrantha [barr e=5mm]

METHODES

RECOLTE ET CONSERVATION DES FRUITS

Les fruits mûrs de Kera udrenia macrantha ont été récoltésau mois de décembre 2012 dans les zones de défricheme nt du site d’exploitation minière d’Ambatovy.
Ils ont été coupés avec leur pédoncule. suite,En ils sont mis dans un sac plastique sur lequel sont mentionnés la date et la zone de récolte ainsi que le code du pied mère. L’ensemble a été conservé dans une glacière à la mpératurete de +5°C jusqu’à la mise en culture.

PREPARATION DU MILIEU DE CULTURE

Durant toutes les expérimentations, le milieu de base de Murashige et Skoog (1962), dilué de moitié (MS/2), additionné de vitamines, de30g.l-1de saccharose, et solidifié par
8g.l-1d’agar a été utilisé. Les compositions de ce milieude base et des vitamines sont enregistrées en annexe IV. La préparation suit lesquatre étapes suivantes :

Préparation des solutions mères

Pour faciliter la préparation du milieu de culture,des solutions mères ont été préparées préalablement (photo 4). Les macroéléments, les microéléments, les vitamines et les régulateurs de croissance ont été respectivement concentrés 50, 100, 100 et 100 fois. Puis, ils sont conservés au réfrigérateur à +4°C. Seule, la vitamine myo-inositol a été utilisée au moment de la préparation du milieu de culture.

Ajustage du pH

Le pH du milieu de culture a été ajusté de 5,5 à 5,6 avec une solution normale de NaOH ou HCl, à l’aide d’un pH-mètre (photo 5).

Homogénéisation et coulage

Après l’ajustage du pH, 8g.l-1 d’agar ont été additionnés dans le milieu de culture. Le mélange a été porté à l’ébullition jusqu’à ce qu’ilprésente une solution homogène. Le milieu est réparti dans des bocaux de culture à raison de 12ml/bocal. Puis, les bocaux sont fermés à l’aide de papier aluminium et scellés avec du parafilm. Le coulage a été effectué sous hotte à flux laminaire.

Stérilisation du milieu de cultur

Les milieux de culture s ont stérilisés par autoclavage à 120°C pend ant 20mn, sous une pression de 1bar (photo 6).
Photo 4 : Solutions mères Photo 5 : Ajustage du pH à Photo 6 : Stérilisation des
préparées l’aide du pH mètre milieux de culture par
autoclavage

GERMINATIO N DES GRAINES

 Milieu de germination

Le milieu de culture utilisé pour la germination des graines in vitro est constitué du milieu de base de Murashige et Skoog diluéde moitié (MS/2), dépourv u des régulateurs d croissance.

Stérilis ation des graine

Les graines ont étéinitia lement lavées à l’eau courante et savonneus e. Puis, elles ont été désinfectées par trempage successif dans la solution de mancozè be (fongicide) 2% additionnée de 2 gouttes de tw een 20 pendant 60mn et dans de l’alcool éthylique70° pendant 1mn. Ensuite, les graines ont été trempé dans la solution d’hypochlorite de calcium (CaOCl2) de concentration 5 %. Les durées de trempage 10mn et 15mn s ont les mêmes que celles utilisées parRamamonjiarisoa, (2004) sur Cinnamomum camphora (L). Finalement, les graines ont été rincées 5 fois à l’eau distillée érilest et trempées dans de l’eau distillée stérile pendant 24h.

Ensemencement des graines in vitro

Les graines ont été ensemencées dans le milieu deaseb MS/2 dépourvu de régulateurs de croissance. Pour chaque temps de trempage (10mn et 15mn), dix répétitions ont été faites à raison de 10 graines par bocal. Au total, 200 graines ont été ensemencées. Les suivis ont été réalisés 2 fois par semaine jusqu’à l’obtention de plantules à feuilles bien formées.

INTRODUCTION
Première partie: GENERALITES
I. CULTURE IN VITRO
I.1. DEFINITION
I.2. DIFFERENTES TECHNIQUES
II. EMBRYOGENESE SOMATIQUE.
II.1. DEFINITIONS
II.2. ORIGINE ET DEVELOPPEMENT DE L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
II.3.TYPE DE L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
II.4. ETAPES DE L’EMBRYOGENESE SOMATIQUE
II.5. DIFFERENTS FACTEURS INFLUENÇANT LA CULTURE DE L’EMBRYON SOMATIQUE
II.5.1.Facteurs internes
II.5.2.Facteurs externes
III. ORGANOGENESE
III.1.CAULOGENESE
III.2. RHIZOGENESE
Deuxième partie: MATERIEL ET METHODES
I. SITE DE PRELEVEMENT DES EXPLANTS
I.1.SITUATION GEOGRAPHIQUE
I.2. CLIMAT
II. MATERIELVEGETAL
II.1. PLANTE MERE
II.1.1. Classification botanique
II.1.2. Description morphologique
II.2. EXPLANTS
III. METHODES
III.1. RECOLTE ET CONSERVATION DES FRUITS
III.2. PREPARATION DU MILIEU DE CULTURE
III.2.1. Préparation des solutions mères
III.2.2. Ajustage du pH
III.2.3. Homogénéisation et coulage
III.2.4. Stérilisation du milieu de culture
III.3. GERMINATION DES GRAINES
III.3.1 Milieu de germination
III.3.2. Stérilisation des graines
III.3.3. Ensemencement des graines in vitro
III.3.4. Paramètres étudiés
III.4. INDUCTION DES CALS
III.4.1. Milieu d’induction
III.4.2. Mise en culture
III.4.3. Paramètres étudiés
III.5. PROLIFERATION DE CALS EMBRYOGENES
III.5.1. Paramètre évalué
III.6. MATURATION ET REGENERATION DE CALS EMBRYOGENES
III.6.1. Milieu de culture
III.6.2. Mise en culture
III.6.3. Paramètres étudiés
III.7. ETUDE HISTOLOGIQUE DES CALS ET DES EMBRYONS SOMATIQUES
III.7.1. Préparation de la coupe
III.7.2. Paramètres étudiés
III.8. CROISSANCE ET ENRACINEMENT DES PLANTULES OBTENUES
III.8.1. Milieu de culture
III.8.2. Mise en culture
III.8.3. Paramètres étudiés
III.9. ACCLIMATATION
III.9.1. Méthode d’acclimatation
III.9.2. Paramètre étudié
IV. TRAITEMENT STATISTIQUE DES RESULTATS
Troisième partie: RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I. GERMINATION DES GRAINES
I.1. EFFETS DE LA DUREE DE TREMPAGE DE GRAINES DANS LA SOLUTION D’HYPOCHLORITE DE CALCIUM (CaOCl2)
I.1.1. Taux de contamination
I.1.2. Taux de germination
II. INDUCTION DES CALS
II.1. EFFETS DES REGULATEURS DE CROISSANCE (2,4-D/ BAP) SUR LA CALLOGENESE A PARTIR DE LA FEUILLE ET DE L’HYPOCOTYLE
II.2. MORPHOLOGIE DES CALS
II.3. PROLIFERATION DES CALS EMBRYOGENES ISSUS DE LA FEUILLE ET DE L’HYPOCOTYLE
III. REGENERATION ET MATURATION DE CALS EMBRYOGENES
III.1. INFLUENCE DE LA COMBINAISON D’ ANA / BAP SUR LA REGENERATION DES EMBRYONS SOMATIQUES ISSUS DE FEUILLES ET D’HYPOCOTYLES
III.2. EVOLUTION DES EMBRYONS SOMATIQUES DU STADE GLOBULAIRE AU STADE COTYLEDONAIRE
III.3. COUPES HISTOLOGIQUES AU NIVEAU DES CALS ET DES EMBRYONS SOMATIQUES
IV. CROISSANCE ET ENRACINEMENT DE PLANTULES DE Keraudrenia macrantha 38
IV.1. CROISSANCE DES PLANTULES
IV.2. ENRACINEMENT DES PLANTULES
V. ACCLIMATATION
Quatrième partie: DISCUSSIONS
DISCUSSIONS
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE