Origine des échantillons environnementaux

Afin d’étudier l’écologie microbienne en relation avec la dégradation de l’ETBE et du MTBE, différents enrichissements ont été effectués et caractérisés. Les caractéristiques des différents échantillons environnementaux utilisés pour réaliser ces enrichissements sont présentées dans le tableau 2.1. II – 2 – 1. Micro-organismes utilisés Bien que des micro-organismes aient été isolés à partir des enrichissements et feront en partie l’objet de ces travaux de thèse, différents autres micro-organismes ont été employés au cours de l’étude et sont présentés dans le tableau 2.2.  Plusieurs milieux de culture ont été utilisés pendant ce travail, notamment, un milieu minéral afin d’effectuer les enrichissements, ainsi que des milieux complexes pour réaliser les isolements ou les clonages, entre autres. Ces milieux sont présentés ci-dessous. (4) La composition de la solution de vitamines (stockée à -20°C) est la suivante : Biotine (200 mg.L-1) ; Riboflavine (50 mg.L-1) ; Acide nicotinamique (50 mg.L-1) ; Panthoténate de Obtention des enrichissements : les échantillons environnementaux (tableau 2.1) dès leur réception au laboratoire avaient été utilisés comme incoculum (20 %) pour ensemencer du MM (150 mL) dans des fioles Schott (500 mL) équipées d’un bras latéral pour effectuer les prélèvements à la seringue. Le substrat désiré (MTBE, ETBE ou TBA) est alors ajouté  (200 mg.L-1) avant fermeture des flacons. La quantité d’oxygène dans le flacon est suffisante pour assurer des conditions aérobies. Les fioles sont incubées sous agitation (100 rpm) à 30 °C. La concentration en substrat résiduel était mesurée par CPG après prélèvement du milieu et filtration (0,22 µ) à t0 puis au cours du temps. Lorsque le substrat était consommé, deux autres repiquages successifs étaient effectués dans les mêmes conditions pour confirmer la capacité de dégradation après repiquage et pour effectuer l’enrichissement. Après ces  3 repiquages, les cultures, considérées comme cultures d’enrichissement, étaient centrifugées et conservées à -80°C.

Remise en culture des enrichissements :

un tube à -80 °C de chaque enrichissement obtenu sur ETBE ou sur MTBE a été remis en culture en juillet 2010 peu avant le début de la thèse dans les conditions décrites ci-dessus pour l’enrichissement. Après suivi et confirmation de leur capacité de dégradation de l’ETBE ou du MTBE, ces cultures ont été utilisées comme inoculum pour réaliser des cultures en plus grand volume permettant d’obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des expérimentations nécessaires (cinétiques de dégradation, extraction d’ADN…). Ces incubations ont donc été réalisées en fioles Schott de 2 ou 3 L contenant 350 mL de MM ensemencé à haut taux (30 %) avec la totalité de la culture de vérification (soit 500 mL final). Le substrat est ajouté avant fermeture du flacon.Les concentrations en substrat étaient 200 mg.L-1 pour l’ETBE et 100 mg.L-1 pour le MTBE. L’incubation est réalisée dans des agitateurs (Infors) à 30 °C. Dans ces conditions il n’y a pas de limitation en oxygène. Chaque substrat est régulièrement dosé par CPG, et des ajouts sont faits quand la concentration résiduelle est nulle. Lorsque le substrat est consommé, la culture est transférée dans une fiole identique stérile (afin d’assurer le renouvellement en oxygène), une nouvelle addition de substrat est effectuée. Ceci permet d’obtenir les quantités de biomasse suffisantes pour effectuer les ensemencements nécessaires aux différentes expérimentations (détermination des capacités de dégradation réalisées en triplicata, extraction d’ADN…). Les prélèvements sont effectués selon les besoins dans la culture et du MM neuf est alors ajouté stérilement. b) Détermination de la biodégradation de différents composés Les capacités de biodégradation des enrichissements pour différents composés (ETBE, MTBE, TBA, BTEXs, n-alcanes, voir liste fournie dans le tableau 2.3) ont été étudiées. Dans des fioles pénicillines de 125 mL contenant 19 mL de milieu MM, on introduit l’inoculum correspondant à l’enrichissement testé. Pour cela, on prélève 40 mL sur la culture d’enrichissement en cours. Cette culture est centrifugée et lavée une fois dans 30 mL de MM puis remise en suspension dans 35 mL de MM. On ensemence les fioles avec 1 mL de cette suspension. Les composés testés sont préalablement dissous dans du HMN (2,2,4,4,6,8,8- heptamethylnonane) afin de diminuer leur toxicité pour les micro-organismes (à raison de 5 µL/0,5 mL HMN) et les 0,5 mL de cette solution ainsi préparée sont introduits dans chaque fiole. Après ensemencement et addition du substrat, les fioles sont immédiatement fermées avec un bouchon en butyl neuf et serties avec une capsule d’aluminium. Les témoins abiotiques de cette expérience sont constitués de fioles identiques contenant 20 mL de MM stérile additionné en substrat, et préparé (x3) dans les mêmes conditions que les fioles d’essai. Toutes ces fioles sont incubées à 30 °C sous agitation (150 rpm) pendant 4 semaines. Cette façon de procéder en fiole fermée est nécessaire car nous travaillons presque exclusivement avec des composés volatiles à très volatiles. Le travail en milieu fermé est donc incontournable pour pouvoir effectuer des bilans crédibles. Par ailleurs, comme l’ensemble des tests est effectué en aérobiose, il est nécessaire de vérifier que la teneur en oxygène présente dans la fiole fermée est suffisante aux micro-organismes.