Optimisation des paramètres de spectrométrie de masse en tandem

Cette opération d’optimisation des gaz est réalisée afin de trouver le bon compromis pour nébuliser et désolvater la solution contenant les ions à analyser. Ici, l’optimisation est réalisée par un système de T, en introduisant dans la seringue une solution de colorant à 100 µg/L en même temps que la phase mobile au débit qui sera utilisé.

Optimisation de la chromatographie liquide

Les tests de gradient ont été réalisés sur toutes les molécules. Cependant, en raison du grand nombre de données, les résultats seront présentés pour le colorant AZB avec la colonne Ascentis .Express C18 (Sigma) (Figure 30). La phase aqueuse utilisée est « Eau + 10 mM acétate d’ammonium + 0.1 % d’acide formique » et la phase organique est « ACN». Les premiers tests n’ont pas été très concluant. En effet, sur le premier chromatogramme (A), le temps de rétention de AZB se trouve dans le temps mort de la colonne (1.63 min). En ajustant le gradient et le temps de passage en phase organique, les temps de rétentions ont été décalés à 2.33 min (B,C) cependant, les pics étaient assez larges et mal résolus. Pour pallier à ce problème, une autre colonne a été mise en place : il s’agit de la colonne Sunfire (Waters) (Figure 31). En raison de pics mal résolus et de temps de rétention trop court (A, B, C), la colonne Sunfire de chez Waters a été testée car elle a été choisie lors d’une ancienne étude sur BG. Sur les chromatogrammes (D, E, F, G), un changement de phase mobile a été réalisé mais aussi la vitesse de passage en phase organique (gradient d’élution). Nous avons observé qu’il est optimal d’utiliser le MeOH comme phase organique avec un temps de passage en phase organique de 3 minutes pour avoir des pics bien résolus et des temps de rétentions satisfaisants. Pour pousser les recherches, une autre colonne avec une nouvelle technologie a été testée afin de comparer les résultats obtenus avec la colonne Sunfire de chez Waters : il s’agit de la colonne Accucore Phenyl Hexyl de chez Thermofisher (Figure 32).D’autre tests de gradients ont été réalisés avec la colonne Accucore Phenyl Hexyl. D’après les chromatogrammes (H, I, J), le meilleur gradient optimal que nous avons sélectionné est le (J). Cette colonne a donc été choisie pour le début de notre phase de développement du protocole d’extraction. Cependant, au cours de notre développement de méthode, un problème chromatographique a été constaté durant les tests de gammes. Trois molécules (MB, NBA et NMB) interféraient avec la colonne Accucore Phenyl Hexyl en laissant paraitre sur les chromatogrammes des trainées de pics (Figure 33). Ceci est dû à une interaction liée avec les molécules et la silice résiduelle (non greffée) de la colonne. Pour résoudre ce problème rencontré, un changement de colonne a été réalisé en adoptant la colonne Sunfire (Waters). Cette nouvelle colonne a été choisi en raison de ses chromatogrammes satisfaisant obtenus lors de l’optimisation de la colonne. Un nouveau gradient (Tableau 16) a été définis pour avoir des pics bien résolus dans un intervalle de temps de 7 à 13 min. 

Optimisation du solvant d’extraction 

Le premier élément optimisé dans le protocole d’extraction est le solvant d’extraction afin d’évaluer sa capacité à extraire les molécules de la matrice (chair+ peau de poisson), notamment en faisant précipiter les protéines. Plusieurs conditions d’extractions ont été testées : solvants seuls (MeOH, ACN), mélanges de solvants pour faire varier la polarité (MeOH/hexane) ou l’acidité (solvant + acide ou tampon), et essai d’ajout d’hydroxylamine avant l’extraction pour faciliter l’extraction (Figure 34). Chaque essai a été comparé avec un blanc afin de pouvoir calculer le rendement total de chaque colorant extrait de la matrice après l’ajout de la solution  de supplémentation en colorant et la solution de standard interne. Les résultats pour cette étape d’extraction se porteront ci-après sur l’AZB. D’après la Figure 34, le rendement d’extraction varie suivant le type de solvants. En effet, l’ajout d’hydroxylamine suivit par l’extraction par un mélange de solvant de « ACN/Tampon Citrate 90:10 » paraissent des conditions favorables pour une extraction optimale de AZB. Cependant, au vu de tous nos colorant analysés, ce solvant n’a pas été retenu en raison de faible rendement pour BG et MG. Le solvant choisi pour la suite des manipulations est donc le « MeOH + 1 % en acide acétique » avec un ajout de 500 µL d’hydroxylamine au préalable. 

Optimisation du solvant de reprise 

Le solvant de reprise est un mélange de solvant utilisé afin de dissoudre le résidu à sec obtenu après évaporation à 50°C. Il sera ensuite filtré dans un filtre à 0.45µm et injecté dans la LCMS/MS. Il doit donc être compatible avec la phase mobile et la solubilité des molécules. Pour cela, 4 solvants de reprise ont été testés afin de comparer les intensités des pics et leur forme. D’après le Tableau 17, le solvant de reprise choisi est donc « ACN/EAU 80:20 » en raison des intensités de pics supérieurs aux autres mais aussi pour une meilleure stabilité des molécules. Le tableau récapitulatif des intensités de pics est représenté en annexe 4.

Mise en place d’une étape de purification

Lors du premier essai, un kit QuEchERS « MgSO4 4g /NaCl 1g » (référence : agilent technologies, Bond Elut – Original QuEchERS extract pouches) a été testé avec comme solvant d’extraction le « MeOH+1 % Acide Acétique ». Puis l’extractions avec le premier kit a été testé avec une purification complémentaire comprenant « MgSO4 1.5 g /C18 0.5 g » (référence : Interchim – Clean up Kit) mais en faisant varier le solvant d’extraction. Les résultats donnés en Figure 35 montrent que l’utilisation de QuEchERS n’est pas très efficace concernant l’extraction des colorants (ici AZB) dans la chair de poisson. Les molécules restent probablement absorbées par les sels. L’étape de purification QuEchERS n’a donc pas donné suite pour l’optimisation de notre protocole d’extraction.