oligonucléotides utilisés en spoligotypage

LES METHODES DE GENOTYPAGE

Les méthodes de génotypage du MTBC ont beaucoup évolué en 20 ans. Les plus fréquemment utilisées pour différents types d’études sont décrites ci-dessous.

Le spoligotypage

C’est une méthode de génotypage spécifique du MTBC qui repose sur le polymorphisme de la région DR (§ 1.3.4.4-b). La technique consiste à amplifier les espaceurs de la région DR et à les identifier par hybridation inverse à un set de 43 oligonucléotides complémentaires de 43 espaceurs de référence (les plus polymorphes) préalablement fixés sur une membrane ou sur microbille. La GENERALITES 26 méthode est résumée sur la figure 12. Les spoligotypes obtenus sont sous la forme d’un code binaire de 43 caractères où les carrés blancs représentent les espaceurs absents et les carrés noirs représentent les espaceurs présents (figure 35-C). D’autres moyens de représentation comme des combinaisons de chiffres (8 ou 6) ont été aussi établis pour la représentation des spoligotypes (Dale et al., 2001). Figure 12: Le spoligotypage A, L’amplification de la région DR ; B, Montage du système d’hybridation inverse ; C, Exemples de spoligotypes. La technique nécessite une quantité moindre d’ADN que le typage par RFLP, car elle est basée sur une amplification de la région DR. Des études ont montré la faisabilité de la technique à partir de crachats de patients tuberculeux positifs à l’examen direct et même à partir d’extrait de lames de diagnostic microscopique positives de TB (Mallard et al., 2010; Suresh et al., 2007). Une variante du spoligotypage utilisant 25 espaceurs en plus des 43 espaceurs a été développée plus tard (Brudey et al., 2004; Van der Zanden et al., 2002). Une version spoligotypage sur la plateforme Luminex® a été développée en 2004 au CDC et en 2010 en Europe (Zhang et al., 2010) avec des combinaisons de 43 et 68 espaceurs. Le Spoligo-RIF, le TB-SPRINT et le TB-SPRINTplus (Gomgnimbou et al., 2015; Gomgnimbou et al., 2012; Gomgnimbou et al., 2013) ont aussi été développées dernièrement pour combiner ce test avec des tests moléculaires de sensibilité aux antituberculeux. Entre autre, un outil disponible en ligne nommé « Spolpred » a été développé pour générer des spoligotypes in silico à partir des « reads » (mélange de courtes séquences oligonucléotidiques de 20 à 200 pb généré par les séquenceurs de nouvelle génération) du séquençage de la région DR (Coll et al., 2012). D’autres études ont aussi développé des méthodes de détermination in silico des spoligotypes (Xia et al., 2016). Malgré son niveau de discrimination relativement faible par rapport à d’autres techniques et le niveau plus élevé d’homoplasie au niveau des espaceurs observé (Comas et al., 2009; Warren et al., 2002), le spoligotypage constitue aujourd’hui une des techniques les plus utilisées dans le monde. C’est une technique moins chère, moins lourde que les autres méthodes de typage et qui a surtout l’avantage d’être standardisée et reproductible dans tous les laboratoires de biologie moléculaire travaillant sur la TB (Sola et al., 1999). Des recommandations de contrôle de qualité ont été également proposées récemment pour les laboratoires travaillant encore sur membrane (Abadia et al., 2011).

Les MIRU-VNTR

La méthode du MIRU-VNTR repose sur l’identification du nombre de copies des unités répétées en tandem des locus VNTR. Pour cela, chaque locus MIRU est amplifié par des amorces flanquantes. Les produits de PCR sont mis à migrer sur électrophorèse sur gel d’agarose pour déterminer la taille des amplicons. Le nombre de copies des éléments répétés GENERALITES 28 est identifié à partir de références de tailles déjà connues (Supply et al., 2000; Supply et al., 2006). Les profils MIRU obtenus sont formés de la suite des chiffres concaténés correspondant chacun aux nombres de copies des unités répétées de chaque locus étudié. Une sélection de 12 locus a été choisie au tout début du typage de M. tuberculosis par les MIRU-VNTR (Supply et al., 2000). Mais plus tard des combinaisons de 15 et de 24 locus ont été adoptées pour optimiser le niveau de discrimination de la méthode (Supply et al., 2006). D’autres études ont proposé diverses combinaisons de locus (Kam et al., 2006; Kremer et al., 2005; Smittipat et al., 2005) mais après des soucis de standardisation inter-laboratoire, Les combinaisons de Supply et al. en 2006 sont actuellement retenues (tableau 2). Tableau 2: Liste des 24 locus VNTR standards utilisés actuellement pour la technique MIRU-VNTR selon leur position chromosomique (Supply et al., 2006) Des études ont mis au point des amplifications multiplexées des locus (Allix-Béguec et al., 2008; Supply et al., 2014; Supply et al., 2001; Supply et al., 2006; Yasmin et al., 2014) ainsi que des détermination de taille d’amplicons sur des appareils de séquençage (ABI 377 GENERALITES 29 automated sequencer ® ou autre) afin de réduire la lourdeur de la méthode (Chin et Jou, 2005; Supply et al., 2001). La méthode des MIRU-VNTR a un niveau de discrimination très élevé (Mazars et al., 2001). La technique est surtout utilisée dans les études d’épidémiologie moléculaire et moins dans des études d’évolution et de phylogénie de M. tuberculosis, même si elle donne aussi d’excellents résultats.

La RFLPIS6110

La RFLPIS6110 (« Restriction Fragment Length Polymorphism – Insertion sequence 6110 ») repose sur l’analyse du nombre et de la position des copies d’IS6110. Pour cela, l’ADN purifié des souches est clivé par une enzyme de restriction PvuII, puis mis à migrer par électrophorèse sur gel d’agarose pour déterminer le nombre et la taille des fragments de restriction puis les IS6110 sont identifiés par des sondes spécifiques (figure 13). Cette technique a permis de classer M. tuberculosis en une trentaine de familles selon le nombre de copies de IS6110 (Van Embden et al., 1993; Yeh et al., 1998).