BNGR-HASS
Obtention des matrices protéiques laitières
La digestion de sept matrices de protéines laitières a été étudiée au cours de cette thèse. Après pasteurisation et écrémage du lait, des étapes de filtration ont été appliquées afin d’extraire les caséines natives et protéines solubles. Cette étape d’extraction a ensuite été suivie de l’application de différents procédés physiques (ajout de protéines solubles), chimiques (déminéralisation via l’ajout d’un acide) ou enzymatique (réticulation par transglutaminase) afin de modifier la structure des matrices protéiques. Finalement, les matrices ont été séchées par atomisation.
Un schéma récapitulatif des différentes étapes d’obtention des matrices sont présentées dans la Figure 23. Obtention des matrices protéiques laitières 90 Figure 23. Procédés d’obtention des matrices laitières. Les matrices obtenues peuvent donc être réparties en différentes catégories : • Les matrices concentrées en caséines micellaires natives, ayant une teneur en calcium d’origine (C1) ou réduite (C2 et C2 low Ca2+ ). • Une matrice de caséine micellaire réticulée par transglutamination (C3). • Une matrice contenant les protéines totales de lait (CW). • Une matrice avec une répartition de caséines et protéines solubles modifiée (CW2). • Une matrice contenant uniquement des protéines solubles (W).
Digestion in vitro : optimisation du protocole et techniques analytiques
Optimisation du protocole de digestion statique in vitro Infogest Comme discuté dans l’introduction bibliographique, le protocole harmonisé Infogest de digestion statique a été optimisé afin de développer un protocole standardisé facilitant la comparaison des données obtenues dans les différents laboratoires.
Ce protocole rassemble des conditions proches de la situation physiologique et faciles à appliquer. De plus, ces conditions sont considérées comme des suggestions de base et peuvent être adaptés en fonction de la question de recherche posée [272]. Ainsi, avant de procéder à la caractérisation nutritionnelle des différentes matrices protéiques au cours de la digestion in vitro, une étude préliminaire a été effectuée afin d’adapter le protocole Infogest aux matrices protéiques étudiées (Figure 24).
En effet, les matrices analysées dans cette thèse sont relativement simples en matière de composition puisqu’elles sont constituées majoritairement de protéines de lait purifiées. Le protocole Infogest, initialement développé pour digérer une large gamme de matrices alimentaires, ne semblait donc pas réellement adapté à la problématique de ce travail. L’adaptation du protocole a donc été principalement réalisée au niveau de la quantité de pancréatine à ajouter en phase intestinale car en suivant les indications du protocole d’origine, une concentration de 100 U.mL-1 de pancréatine était nécessaire pour digérer les matrices protéiques (sur la base de l’activité trypsique).
Cela aurait était équivalent à 732,8 mg de pancréatine (ou 18,32 mg.ml -1 de fluide digestif intestinal) donnant ainsi un rapport enzyme/substrat (m/m) proche de 1 (732,8 mg de pancréatine pour 800 mg de protéines). Tout en étant plus rentable, l’avantage d’une diminution de la quantité de pancréatine permet une identification plus aisée par spectrométrie de masse des peptides obtenus au cours de la 93 digestion, la proportion de peptides issus de l’autolyse des enzymes intestinales étant ainsi diminuée.
Dans cette étude préliminaire, des quantités croissantes de pancréatine ont été testées afin de retrouver une population peptidique, issue de la matrice protéique, similaire à celle obtenue avec la quantité de pancréatine recommandée. Sur la base de cette étude préliminaire, une quantité de 200 mg de pancréatine a été choisie pour l’étape de caractérisation des matrices protéiques au cours de la digestion in vitro. Le déroulement de l’optimisation du protocole Infogest pour la quantité de pancréatine utilisée en phase intestinale sont détaillés dans l’Article 1 de cette thèse.
Principe des techniques analytiques
La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) Le principe de la SEC (pour « Size Exclusion Chromatography » en anglais) repose sur la séparation des molécules en fonction de leur taille. La phase stationnaire est formée d’un gel constitué de billes poreuses ayant une distribution de taille spécifique, et la phase mobile est hydrophile ou hydrophobe en fonction de la phase stationnaire [273].
Les petites molécules diffusent dans les pores, et leur passage à travers la colonne est retardé en fonction de leur taille, tandis que les plus grosses molécules ne peuvent pas pénétrer dans les pores et sont donc éluées dans le volume mort de la colonne. Ainsi, les molécules sont séparées par ordre de poids moléculaire décroissant. La mise en place d’une courbe d’étalonnage basée sur l’élution d’un ensemble d’analytes de poids moléculaires connus peut alors être utilisée pour estimer le poids moléculaire d’analytes inconnus [273].
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