NANOPARTICULES D’OXYDES MÉTALLIQUES

INTERACTIONS ENTRE DES NANOPARTICULES MANUFACTUREES ET DES MODELES BIOLOGIQUES 

 Problématique

Ce chapitre est consacré à l’étude des effets biologiques des nanoparticules manufacturées sur différents modèles cellulaires (cellules humaines et micro-organismes). Ce travail s’inscrit dans une démarche d’évaluation des risques environnementaux et toxicologiques liée à la production croissante des nano-matériaux (cf. chapitre I). Même si ces risques pouvaient apparaître anecdotiques il y a peu de temps, il existe de plus en plus d’évidences d’un impact biologique néfaste des nanoparticules manufacturées. Il semble que certaines d’entre elles puissent induire un stress oxydatif au niveau du cerveau de poissons (Oberdörster et al., 2004), altérer le comportement et le cytosquelette des cellules humaines (Berry et al., 2003 ; 2004a ; 2004b), engendrer des effets génotoxiques chez les souris (Freitas et al., 2002 ; Sadeghiani et al., 2004) ou encore avoir un pouvoir bactéricide et fongicide (Stoimenov et al., 2002). Mais, comme nous l’avons dit précédemment (cf. chapitre I), les études toxicologiques portant sur les nanoparticules manufacturées sont encore peu nombreuses et les résultats souvent contradictoires ce qui donne lieu à de véritables polémiques entre les chercheurs concernés. Ces divergences viennent du fait que les propriétés physico-chimiques de la surface des nanoparticules ainsi que les conditions d’adressage aux organismes vivants sont mal contrôlées. Pourtant, comme nous le montrerons, l’évolution de ces deux paramètres mérite d’être suivie avec attention lors de l’étude des interactions nanoparticules/cellules. L’objectif de notre étude est de mieux définir les effets cytotoxiques et génotoxiques des nanoparticules d’oxydes métalliques sur des bactéries et des cellules humaines en fonction de leurs propriétés physico-chimiques de surface. Une attention particulière a été mise sur la caractérisation des nanoparticules en amont des tests avec les cellules ou bactéries (cf. chapitre II et chapitre III), dès leur mise en suspension dans le milieu extracellulaire et à la fin des tests toxicologiques. Cela a permis d’apporter des éléments de réponses aux questions suivantes : Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 98 – Qu’elle est l’évolution de la stabilité colloïdale des nanoparticules dans les milieux extracellulaires en fonction de leurs propriétés de surface (fonctionnalisation de la surface, adsorption de protéines…). Cet état d’agrégation/dispersion peut-il affecter l’adsorption ou l’internalisation des nano-objets sur les cellules ainsi que les effets biologiques constatés ? Des études ont montré que dans les milieux biologiques complexes (pH neutre, riches en sucres, sels, protéines, lipides, enzymes…) la distribution des charges de surface des nano-oxydes est gouvernée par l’adsorption des molécules organiques (Limbach et al., 2005). Cette adsorption entraîne une passivation de la surface ce qui diminue les forces de répulsion entre les nanoparticules et induit une forte agrégation (Limbach et al., 2005 ; Auffan et al., 2006) (Figure IV.1). Figure IV. 1 : agrégation des nanoparticules d’oxydes métalliques dans le milieu de culture des cellules humaines (DMEM). Exemple des nano-maghémites. Mais cette affinité des nanoparticules pour les molécules organiques suppose qu’une forte interaction peut se produire entre les nano-oxydes et les protéines formant des membranes cellulaires. Dans ce cas, les nanoparticules auront une forte affinité pour les membranes cellulaires. Ce contact direct nanoparticules/membranes peut modifier la viscosité membranaire, perturber le métabolisme des cellules ou des bactéries (la respiration), interférer avec les échanges ioniques et électroniques entre les milieux intra et extracellulaires ou encore induire un stress oxydatif. – Existe-il une relation entre les réponses cyto- et génotoxiques des modèles biologiques et des modifications de la spéciation des atomes de surface des nanoparticules ? Cette évolution physicochimique peut-elle induire un stress oxydatif chez les cellules et des altérations de l’ADN ? Existe-il un effet réel de la taille (surface spécifique, réactivité de surface) ? En fonction de leur propriétés redox, les oxydes métalliques ne sont pas stables en solution et vont subir des oxydations ou des réductions pouvant engendrer un stress oxydatif pour les cellules (Schoonen et al., 2006). Par définition, un stress oxydatif se produit lorsque les cellules ne contrôlent plus la présence excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) (Favier et al., 2003). Les ROS sont produits naturellement par des mécanismes physiologiques car ils sont utiles pour l’organisme, mais en présence d’agents toxiques, leur production devient excessive et les cellules vont devoir se protéger de cet excès par des systèmes antioxydants (Chaudière et al., 1999 ; Gardès-Albert et al., 2003). Les minéraux peuvent induire un stress oxydatif directement par la génération de ROS (relargage d’ions en solution, présence de défaut cristallin en surface, réactions redox se produisant à la surface…) ou indirectement (par l’oxydation de molécules organiques dans le milieu cellulaire) (Schoonen et al., 2006). Du fait de leur grande surface spécifique et de la forte réactivité de surface, il est possible que la génération de ROS par les nano-oxydes soient plus importante que pour des oxydes de tailles micrométriques. La génération d’un stress oxydatif a été mise en évidence pour des particules atmosphériques ultrafines et certaines nanoparticules manufacturées (e.g. Hoet et al., 2004 ; Oberdörster et al., 2005 ; Gurr et al., 2005 ; Shvedova et al., 2005 ; Nel et al., 2006 ; Lanone et al., 2006 ; Xia et al., 2006). Cependant, les mécanismes physico-chimiques se produisant à l’interface nanoparticules/cellules et responsables ce de stress oxydatif restent encore mal connus. Afin de répondre à ces questions, notre étude a concerné quatre types de nano-oxydes métalliques à savoir les nano-maghémites, nano-magnétites, nano-CeO2 et nZVI. Ces particules présentent l’avantage d’être de taille et de forme similaires mais de nature chimique et d’état d’oxydation différents. Cela nous a permis de comparer les effets biologiques des nanoparticules sur les bactéries et les cellules humaines en fonction de leur physico-chimie de surface. Une synthèse bibliographique des études ayant portées sur les effets biologiques des nano-CeO2 et des nanoparticules à base de fer est donnée ci-aprés. Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 100 1.2 Synthèse bibliographique 

Les nano-CeO2 : ont-elles un rôle protecteur ou un effet toxique pour les cellules ? 

À ce jour, moins d’une dizaine d’études ont porté sur les effets biologiques des nano-CeO2 et leurs résultats se révèlent très contradictoires. La cytotoxicité de nano-CeO2 de 20 nm de diamètre a été observée sur des fibroblastes de rongeurs, des cellules mésothéliales et de poumons humains (Limbach et al., 2005 ; Brunner et al. 2006, Lin et al., 2006). Très rapidement, les nano-CeO2 sont internalisées par les fibroblastes via des vésicules d’endocytose. Il s’agit d’une invagination de la membrane externe qui se resserre pour former des vésicules contenant les nanoparticules (Alberts et al., 1983). Après 3 jours d’incubation avec 30 mg/L de nano-CeO2, une diminution significative de la viabilité cellulaire de 10 à 25% est observée pour les fibroblastes de souris, de 45 à 60% pour les cellules mésothéliales et de 54% pour des cellules du poumon. Dans ce dernier exemple, la cytotoxicité est liée à un stress oxydatif comme le prouve la forte production de ROS et la diminution de la concentration en glutathion de 40% et α-tocophérol de 88%, deux antioxydants majeurs (Lin et al., 2006). Les auteurs supposent que ces ROS sont générés lors des cycles redox ! CeIV «  »#CeIII «  »#CeIV se produisant en surface des nano-CeO2 qui entraînent des transferts d’électrons et d’oxygènes importants. Ces cycles ont un intérêt dans les applications catalytiques utilisant des nano-CeO2 car ils sont à l’origine de la capacité des nano-CeO2 à stocker et relarguer l’oxygène (Bedrane et al., 2002 ; Kaspar et al., 2003). Mais le lien entre ces transformations redox de la surface et leurs effets biologiques n’a pas été démontré. A l’opposé, il semble que les nano-CeO2 peuvent également protéger les cellules d’un stress oxydatif généré par des agents toxiques extérieur (Tarnuzzer et al., 2005 ; Schubert et al., 2006 ; Das et al., 2007). Dans ce cas, les nano-CeO2 agiraient comme des anti-oxydants qui limiteraient les quantités de ROS disponibles pour induire un stress oxydatif chez les cellules. Il apparaît donc une contradiction majeure entre ces différents travaux. 

 Les nanoparticules à base de fer : dans qu’elle mesure leur toxicité est-elle avérée ? 

Bien que le fer soit un élément essentiel à la vie, une augmentation de sa concentration en milieu cellulaire peut générer la formation de ROS (Alberts et al., 1983). Or, dans la plupart de leurs applications, les nanoparticules d’oxyde de fer sont en contact avec les cellules voire le milieu intracellulaire. Il est donc probable que les interactions nanoparticules d’oxyde de fer/cellules ne soient pas anodines. C’est notamment le cas des nanoparticules de magnétite dont la toxicité vis-à-vis des cellules humaines a été démontré (Berry et al., 2003 ; 2004). Les nanoparticules d’oxyde de fer utilisées à des fins biomédicales (Gupta et al., 2005) sont généralement fonctionnalisées en surface via Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 101 le greffage de composés organiques (e.g. Kim et al., 2001 ; Goetze et al., 2002 ; Lacava et al., 2002 ; Chunfu et al., 2004 ; Xu et al., 2005 ; Kim et al., 2005). Cette couche organique limite les contacts directs entre le fer des nanoparticules et les composants cellulaires. Comme l’indique la table IV.1, la nature de l’enrobage joue un rôle important dans les effets biologiques des nanoparticules. Table IV. 1: impacts biologiques des nanoparticules d’oxyde de fer. Nanoparticules Diamètre Types cellulaires Effets observés Références MnFe2O4 Injection intrapéritonéale chez des souris Inflammations dans la cavité péritonéale. Lacava et al., 1999 γFe2O3 Injection intraveineuse dans des souris Inflammation des poumons qui disparaît avec le temps. (0.2 g/L) Pereira Garcia et al., 2005 γFe2O3 (DMSA) Cellules nerveuses Diminution de la capacité de différenciation des cellules nerveuses en présence de nanoparticules enrobées de DMSA. (1 g/L) Pisanic II et al., 2007 γFe2O3 (DMSA, dextran, albumine) Macrophage de souris Cellules humaines tumorales ovariennes Internalisation des nanoparticules avec ou sans enrobage de dextran, d’albumine et de DMSA. (1g/L) Wilhelm et al., 2002 ; 2003 Fe3O4 Injection intraveineuse dans des souris Effets génotoxiques observés aprés une semaine. Sadeghiani et al., 2004 Fe3O4 Cellules du foie de souris Pas de toxicité aux doses testées. (0.25 g/L) Hussain et al., 2005 Fe3O4 (PEG, acide folique et lactobionique) Macrophages de souris Cellules humaines cancéreuses du sein Cellules du foie Internalisation des nanoparticules avec ou sans enrobage de PEG, d’acide lactobionique ou d’acide folique. (0.2 g/L) Zhang et al., 2002 ; 2005 ; Kamruzzaman et al., 2007) Fe3O4 (dextran, albumine) Fibroblastes dermiques humains Internalisation des nanoparticules avec ou sans enrobage. Cytotoxicité des nanoparticules non-enrobées et enrobées de dextran. Augmentation de la prolifération cellulaire en présence de nanoparticules enrobées d’albumine. (0.05 g/L) Berry et al., 2003 ; 2004a Fe3O4 (transferrine) Fibroblastes dermiques humains Pas d’internalisation des nanoparticules enrobées de transferrine. Augmentation de la prolifération cellulaire. (0.05 g/L) Berry et al., 2004b Oxyde de fer Cellules humaines et fibroblastes de rongeurs Diminution de la viabilité et du contenu en ADN. (7 mg/L) Brunner et al., 2006 Oxyde de fer (lactoferrine, ceruloplasmine, polyéthylène glycol) Fibroblastes dermiques humains Internalisation des nanoparticules nonenrobées et perturbation de l’organisation du cytosquelette. Pas d’internalisation des nanoparticules enrobées de lactoferrine, ceruloplasmine et de PEG. (0.1 gL) Gupta et al., 2004 ; 2005 En fonction de leur enrobage, les nanoparticules peuvent être internalisées ou adsorbées en surface des cellules et induire des effets toxiques (Berry et al., 2003 ; 2004b). Elles peuvent également être internalisées et améliorer la prolifération cellulaire (Berry et al., 2004a). L’hétérogénéité des réponses, réside dans le fait que la stabilité de l’enrobage n’est pas suivie lors des études toxicologiques. Si l’enrobage est désorbé lors de l’incubation avec les cellules, un contact direct entre la surface des nanoparticules et les cellules se produit ce qui peut être une source de toxicité. En revanche si l’enrobage est maintenu, c’est la toxicité de l’enrobant généralement choisi pour sa biocompatibilité qui sera analysée. Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 102 Ce chapitre est divisé en deux parties correspondant aux effets biologiques potentiels des nanoparticules d’oxydes métalliques sur un modèle biologique environnemental (Escherichia coli) (cf. partie IV-A) et un modèle cellulaire humain (fibroblastes dermiques) (cf. partie IV-B). Nous tenterons d’illustrer avec différents couples nanoparticules/cellules comment les propriétés physico-chimiques des nanoparticules influencent les réponses biologiques et quels sont les mécanismes de toxicité potentielle des nanoparticules manufacturées. 

EFFETS BIOLOGIQUES DES NANOPARTICULES MANUFACTUREES SUR DES BACTERIES ENVIRONNEMENTALES 

Résumé étendu des articles 

Cette partie est consacrée à l’étude de l’interaction entre des nanoparticules manufacturées et un modèle de bactérie environnementale, Escherichia coli. Un avantage de travailler avec E.coli en condition in vitro est de pouvoir moduler les conditions de milieux lors de l’adressage des nanoparticules aux cellules. Ainsi, nous avons pu adapter le pH et la FI de la solution nutritive afin de maintenir les nanoparticules dispersées lors de l’interaction avec E.coli sans trop s’éloigner des conditions de culture bactérienne. Cela a permis d’intensifier les contacts entre la surface de quatre types de nanoparticules à base de fer (FeII , FeIII, Fe°) et de cérium et les bactéries. L’objectif a été d’établir les relations existant entre l’écototoxicité potentielle de ces nanoparticules et leur propriétés physico-chimiques de surface en solution. Nos travaux ont montré une forte affinité entre les nanoparticules et la membrane externe d’E.coli. L’adsorption des nanoparticules est certainement contrôlée par des attractions électrostatiques. Mais le résultat le plus intéressant concerne l’étroite relation existant entre la sensibilité à l’oxydation des nanoparticules à base de fer et leur cytotoxicité : – Les nano-maghémites (FeIII – forme oxydée) : elles sont chimiquement stables au contact d’E.coli et n’induisent aucune toxicité significative. – Les nano-magnétites (FeII/FeIII – forme intermédiaire) : leur surface s’oxyde en maghémite au contact d’E.coli via une désorption du FeII de leur structure. Une cytotoxicité apparaît à partir de 0.7 g/L de Fe3O4. – Les nZVI (Fe° – forme réduite) : elles sont entièrement oxydées en lépidocrocite (FeIII) et magnétite (FeII/FeIII) dans l’eau et au contact d’E.coli. Dès l’introduction de 0.07 g/L de Fe° 70% de cytotoxicité apparaît. Nous avons pu montrer que la diminution de la survie bactérienne était liée à un stress oxydatif des bactéries. Ce stress peut provenir d’une perturbation de l’activité métabolique des bactéries due à l’adsorption des nanoparticules sur la membrane (modification de la viscosité membranaire, altération des échanges ioniques et électroniques à travers la membrane…). Nous présumons également que des ROS puissent être produits par des réactions de type Fenton (réaction chimique toxique produisant des ROS à partir du FeII), lors de l’oxydation du Fe° (EhFeII/Fe°=-0.44 V) des nZVI et lors du relargage du FeII de la magnétite (EhFeIII/FeII=0.77 V). Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 104 Les résultats présentés dans cette partie IV-A ont fait l’objet d’un article soumis à Environmental Science and Technology en 2007 qui traite de l’écotoxicité des nano-maghémites, nano-magnétites et nZVI. Des travaux équivalents ont également porté sur l’écotoxicité des nano-CeO2 vis-à-vis d’E.coli. Cette étude a été effectuée par Antoine Thill et Olivier Spalla (LIONS, CEA Saclay) en collaboration avec le CEREGE et pour laquelle j’ai collaboré en ce qui concerne l’étude de l’évolution structurale des nano-CeO2. Ces résultats ont fait l’objet d’un article publié dans Environmental Science and Technology en 2006 (cf. annexe 3). Thill, A. Zeyons O., Spalla O., Chauvat F., Rose J., Auffan M. Flank A-M. Cytotoxicity of CeO2 Nanoparticles for Escherichia coli. Physico-Chemical Insight of the Cytotoxicity Mechanism. 2006, Environmental Science and Technologie, 40(19): 6151-6156. Brièvement, ces résultats ont montré la forte affinité des nano-CeO2 pour la membrane d’E.coli (capacité maximale de rétention par les nano-CeO2 : 13 mg nano-CeO2/m2 de surface bactérienne). Cette adsorption n’est pas sans conséquence car dès l’introduction de 0,003 g/L de nano-CeO2, le taux de survie bactérienne diminue de ~50%. Un suivi de l’état redox de la surface des nanoparticules par XANES au seuil du cérium a révélé la réduction du CeIV en CeIII de la surface des nano-CeO2 (EhCeIV/CeIII=1.47 V). Cette réduction se produisant au niveau de la membrane bactérienne est très probablement reliée à l’écotoxicité observée. Ainsi en termes de mécanismes, il semble exister des similitudes entre cette étude et celle qui concerne l’écotoxicité des nano-oxydes de fer. Dans les deux cas, les effets redox à la surface des nanoparticules semblent être le mécanisme initial induisant directement ou indirectement les effets cytotoxiques. La différence majeure concerne la teneur à laquelle une toxicité apparaît. À taille et forme équivalente, les nano-CeO2 induisent des effets cytotoxiques pour des doses 10 à 100 fois moins importantes que pour les nZVI et les nano-magnétites. ❖ ❖ ❖ Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 105 1. Relation between the redox state of iron-based nanoparticles and their cytotoxicity towards Escherichia Coli Mélanie Auffan, CEREGE, CNRS – Université Paul Cézanne, Aix-en-Provence, France Wafa Achouak, LEMIRe, CEA – CNRS – Université de la Méditerrannée, Cadarache, France Jérôme Rose, CEREGE, CNRS – Université Paul Cézanne, Aix-en-Provence, France Corinne Chanéac, LCMC, CNRS-UPMC, Paris, France David T. Waite, New South Wales University, Sydney, USA Armand Masion, CEREGE, CNRS – Université Paul Cézanne, Aix-en-Provence, France Joseph Woicik, NSLS Brookhaven National Laboratory, New York, USA Mark R. Wiesner, Duke University, Durham, Caroline du Nord, USA Bottero Jean-Yves, CEREGE, CNRS – Université Paul Cézanne, Aix-en-Provence, France 1.1 Introduction Accompanying the rapid emergence of nanotechnology and the increasing use of nanoparticles, a new discipline has emerged, that of the nanotoxicology (Oberdörster et al., 2005). Indeed, as with most new technologies and after recent great crisis (GMO, prion and “mad cow disease”) our society requests for more information concerning health and environmental effects. Only few studies have been initiated of the potential toxicity of nanoparticles and it is not clear, on the basis of these limited studies, whether the size of the nanoparticles or their particular surface chemistry is the key determinant of toxicity. Nevertheless, some useful insights into aspects of nanotoxicology have begun to emerge. Firstly, some studies have shown that once dispersed and surface-passivated, nanoparticles can be internalized by cells without inducing any cytotoxic effect (Auffan et al., 2006; Berry et al., 2003; Berry et al., 2004b). Consequently, the fact that nanoparticles are of similar size to biological compounds (e.g. DNA, membrane, proteins) does not appear to be a key element of the toxicity of these particles. Rather, it appears that the chemistry of the nanoparticles (Adams et al., 2006; Brunner et al., 2006) and the physico-chemical reactions that occur at the nanoparticle/cell interface are the key to the biological effect (Thill et al., 2006). In particular, it has been demonstrated that nanoparticles can affect biological targets through generation of reactive oxygen species (ROS) thereby inducing an oxidative stress (Long et al., 2006; Xia et al., 2006). To date however, the causal mechanisms linking the physico-chemical properties of nanoparticles with their biological effects are not well defined. Indeed, further investigations of these mechanisms must be the primary focus of future nanotoxicology studies. It is known that mineral surface may promote the formation of ROS species via different pathways: dissolution and release of metals, presence of structural defects, activation of the immune systems generating secondary cellular ROS and catalysis of the reducion of O2 via electron transfer (redox) reaction (Schoonen et al., 2006). In this last case, the mineral surface (particularly of minerals containing transition metals such as iron) plays an active role. For instance, it has been demonstrated Chapitre IV – Interactions entre des nanoparticules manufacturées et des modèles biologiques 106 that the reaction between FeII and O2 is much faster when FeII ions are adsorbed at the surface of a mineral than when FeII ions are dissolved (Wehrli et al., 1989). Due to the large specific surface area of nano-sized particles, the rate of surface-mediated reactions such as this will be enhanced. Consequently, it is necessary to determine the underlying mechanisms and key factors responsible for the oxidative stress induced by nanoparticles in order to properly ameliorate risk (Robichaud et al., 2005). The present work is focused on studies of three iron-based nanoparticles characterized by three different redox states: γFe2O3 (FeIII), Fe3O4 (FeII/ III) and metallic iron (Fe°) nanoparticles. These nanoparticles are widely used and studied for a variety of applications ranging from the biomedical to the environmental fields. Fe° nanoparticles are used in soil and groundwater decontamination (Zhang, 2003) while the superparamagnetic and adsorbing properties of γFe2O3 and Fe3O4 nanoparticles permit their use as contrast agents for magnetic resonance imaging and cancer therapy and as nano-adsorbants in water treatment (Gupta and Gupta, 2005b; Wiesner and Bottero, 2007). Following the development of iron-based nanoparticles, preliminary investigations of their potential toxicity towards human health and environment have been undertaken (Berry et al., 2004a; Berry et al., 2003; Berry et al., 2004b; Brunner et al., 2006; Gupta and Gupta, 2005a; Hussain et al., 2005; Pisanic Ii et al., 2007). While the results are rather inconsistent, they do suggest that iron-based nanoparticles can be toxic in in vitro experiments. Intercomparison between the various studies have been undertaken however is problematic due to differences in the experimental protocols used including purity of particles, cellular strain and conditions under which the nanoparticles are presented to cells. In this paper, we compared the toxic effects associated with Fe3O4, γFe2O3 and Fe° nanoparticles using gram-negative Escherichia coli as the test organism. The objectives were (i) to determine the concentrations at which the nanoparticles suspensions would be toxic as a function of the Fe redox state, and (ii) to characterize from the macroscopic to the atomic scale the physico-chemical mechanisms responsible for this toxicity. 

Materials and Methods

Nanoparticles Magnetite (Fe3O4) 

nanoparticles (Nmagnet) were synthesized by precipitation from solutions containing both ferric and ferrous iron with [Fe3+ ]/[Fetotal] of 0.66. Iron cations were distributed into the octahedral (Oh) and tetrahedral (Td) sites according to [Fe3+ ]Td[Fe3+ Fe2+ ]OhO4 (Jolivet et al., 2004). Maghemite (γFe2O3) nanoparticles (Nmag) were obtained via oxidation of magnetite nanoparticles under acidic conditions. Oxidation of Fe2+ ions is correlated with the migration of cations through the lattice framework creating cationic vacancies in order to keep the charge balance. The iron atoms are distributed into the Oh and Td sites according to [Fe3+ ]Td[Fe5/3 3+ V1/3]OhO4 (Jolivet et al., 2004). Transmission electron microscopy and X-ray diffraction measurements have shown that these nanoparticles (Nmagnet et Nmag) are well crystallized and roughly spherical with a mean coherent diameter of 6±1 nm (Jolivet et al., 2002). The specific surface area was measured at 172 m2 /g (by adsorption of N2 following a BET analysis). The nZVI particles were prepared by adding an aqueous solution of 0.16 M NaBH4 dropwise to a 0.1 M FeCl3.6H2O solution as described by Wang and Zhang (Wang and Zhang, 1997). Ferric ion was reduced and Fe° precipitated according to the following reaction: ! Fe(H2O)6 3+ + 3BH4  » + 3H2O ##$Fe0 + 3B(OH)3 +10.5H2 (Wang and Zhang, 1997). The Fe0 particles were washed three times with 10-4 M HCl. The obtained-nZVI have a specific surface area of 32 m2 /g (Joo et al., 2005) and an average primary particle size of 50nm. 

Size measurement 

The average hydrodynamic size of Nmag, Nmagnet and nZVI as a function of pH were determined by dynamic light scattering using a Nanotrac® (Microtrac, USA) instrument. Particle size was analyzed by suspending nanoparticles in 0.01 M NaCl solution at room temperature and the pH adjusted using solutions of 0.1 M HCl and 0.1 M NaOH. 

 Toxicity assessment

 Two kinds of Escherichia coli strains were used in this study: a wild strain called E.coliWT (EC1 Qc1301 MG 1655) and a mutant called E.coliSodAB (EC12 Qc 2472) from which superoxide dismutase has been removed (Carlioz and Touati, 1986). Both of these strains were aerobically grown at 30°C for 12h in Luria Bertani medium (LB) containing 5 g/L of yeast extract 10 g/L of bactotriptone, and 10 g/L of NaCl. Two antibiotics, kanamycine (50 µg/mL) and chloramphenycol (25 µg/mL), were added to the LB medium of E.coliSodAB. The saturated cultures were diluted in fresh LB medium overnight with shaking (at 30°C, 144 rpm). For the survival tests, 1 mL of these bacterial suspensions (containing 109 bacteria) were centrifuged (8000 rpm, 4°C, 5 min) and rinsed three times in ultrapure water. Different concentrations of E.coliWT and E.coliSodAB (from 1.25×103 to 5×107 bacteria/mL) were incubated with varying amounts of Nmag, Nmagnet and nZVI solutions (from 7 to 700 mg/L of NPs) diluted in ultrapure water at pH 5. Two controls of NP-free bacteria were prepared by incubating both bacterial types for 1h in ultrapure water at physiological pH 7.4 and pH 5. After 1h at 30°C the inoculated bacteria were spread on solid LB-agar plates and were incubated overnight at 30°C. Colonies were counted and compared to the control plates to calculate the percentage of growth inhibition. All treatments were prepared in triplicate and repeated two times. Data were expressed as the mean ± SD of these experiments. The Student’s t-test was used for significance testing.