Morphologie, Structure et Organisation génomique

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Définition et classification du VIH

Le VIH est un lentivirus appartenant à la famille des Retroviridae et à la sous-famille des Orthoretrovirinae. Les Retroviridae (ou Rétrovirus) constituent une vaste famille de virus à ARN simple brin de polarité positive et de haut poids moléculaire (environ 10 Kb) caractérisée par la présence d’une enzyme structurale, la transcriptase inverse (TI) et par leur mode de réplication. La transcriptase inverse est capable de synthétiser, à partir de l’ARN viral, un ADN double brin qui va s’intégrer dans le génome de la cellule hôte. Il se réplique alors en même temps que le génome de la cellule hôte (Girard et al, 2011).
Actuellement, la famille des Rétrovirus a été divisée en sept genres par l’ICTV :
International Committee on Taxonomy of Viruses (http://ictvonline.org).
Cette classification est basée essentiellement sur la comparaison des séquences du gène pol.
On distingue les:
– Alpha-Rétrovirus (Rétrovirus type C aviaires)
– Beta-Rétrovirus (Rétrovirus type B mammifères)
– Gamma-Rétrovirus (Rétrovirus type C)
– Delta-Rétrovirus (BLV-HTLV)
– Epsilon-Rétrovirus (Rétrovirus type D)
– Lentivirus et les Spumavirus
Les Lentivirus, dont le VIH-1 sont caractérisés par une longue période d’incubation, d’où leur nom lentivirus qui vient du latin lentis signifiant lent. Ils sont tous cytopathogènes et sont responsables d’atteintes du système nerveux, des poumons, des systèmes articulaires et des cellules hématopoiétiques.
Le Syndrome de l’Immunodéficience Acquise (SIDA) est causé chez l’homme par deux lentivirus, le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1 et 2 (VIH-1 et VIH-2).
Le SIDA a été reconnu pour la première fois comme nouvelle maladie en 1981 lorsqu’un nombre important d’homosexuels ont succombé d’infections opportunistes et de rares cancers (CDC 1981; Greene 2007). Un rétrovirus, nommé VIH-1, a par la suite été identifié comme étant l’agent causal de l’infection qui dès lors devient l’une des maladies infectieuses émergentes les plus dévastatrices de l’histoire (Barre-Sinoussi et al. 1983; Gallo et al. 1984; Popovic et al. 1984). Le VIH-1 se transmet par voie sexuelle, sanguine et verticale (Mère-enfant) (Hladik et McElrath 2008; Cohen et al. 2011).

Origines du VIH

L’origine du VIH-1 chez les primates non-humains a été tracée à travers le virus simien du chimpanzé SIVcpz, qui a infecté des communautés de chimpanzés isolées au sud du Cameroun. L’ancêtre du VIH-1 est probablement passé des chimpanzés à l’humain par transmission hématogène. L’analyse phylogénétique du VIH-1 et des virus apparentés des primates non humains suggère que quatre évènements de transmission indépendante inter-espèce précoce durant le 21ème siècle n’ont pas toutes eu la même issue virologique et épidémiologique.
En effet, seul le VIH-1 groupe major M, découvert en 1983, a diffusé à l’échelle mondiale et est responsable de la pandémie qui touche aujourd’hui plus de 21 millions de personnes dans le monde.
Le VIH-1 groupe outlier O a été identifié au début des années 1990 chez des patients camerounais et est limité à une épidémie restreinte dans la région du bassin du Congo où il représente moins de 1 % des infections VIH-1. Des données au Cameroun suggèrent que la prévalence du VIH-1 O reste stable autour de 1 %.
Le VIH-1 non major-non outlier N, décrit en 1998, et le VIH-1 P, décrit en 2009, ont été observés chez très peu d’individus. (Martine Peeters et Marie Laure Chaix, 2013)
Bien que les souches apparentées aux groupes M et N aient été découvertes chez les chimpanzés, une preuve récente suggère que le VIH- 1 groupe O serait originaire des gorilles SIVgor, chez lesquelles les proches parents de ce groupe ont été identifiés. Il est supposé que les virus qui se propagent chez l’homme le long du fleuve Congo dans le Kinshasa au Zaire seraient le premier cas documenté d’infection à VIH (souche du groupe M) de l’homme à travers des analyses réalisées sur des prélèvements sanguins de 1959. Les données phylogénétiques existantes confortent que le VIH-1 groupe P serait originaire du gorille, mais trop peu de souches SIVgor avait été caractérisées pour identifier la région où cette transmission aurait eu lieu (Hemelaar 2012).
Les franchissements de la barrière d’espèce pour les groupes M, N et P ont certainement eu lieu dans le Sud du Cameroun où les réservoirs des ancêtres de ces trois variants viraux ont été retrouvés.
Cela coïncide avec la distribution géographique des infections VIH-1 N et P. La localisation de la transmission inter-espèce à l’origine du groupe O n’a pas encore été identifiée, mais pourrait se situer dans le Sud du Cameroun ou une région proche, correspondant à la zone épidémique. Néanmoins, pour le groupe M, l’épicentre de la pandémie est situé en RDC à plusieurs centaines de kilomètres du Sud-Est du Cameroun. Diverses hypothèses existent pour expliquer cette différence de localisation entre l’origine du virus et l’origine de l’épidémie. Il s’agit probablement d’une combinaison de plusieurs facteurs liés au virus et aux conditions socioéconomiques et démographiques.
Il est clair que l’histoire naturelle de l’infection à VIH-2 diffère considérablement de celle du VIH1. La provenance du VIH-2 des mangabeys fumés a été énoncée pour la première fois en 1989 (Hirsch et al. 1989) et ensuite confirmé en démontrant que des humains en Afrique de l’Ouest hébergent les souches de VIH-2 qui ressemblait à l’infection locale à SIVsmm circulant. En effet, les homologies entre le VIH-2 et le SIVsmm ainsi que la coïncidence géographique entre l’épicentre de l’épidémie de VIH-2 et l’aire de répartition des mangabés enfumés confirment que les SIVsmm des mangabés sont les ancêtres du VIH-2 présent aujourd’hui chez l’Homme. La caractérisation de nombreuses souches de SIVsmm, provenant d’animaux sauvages ou captifs, a montré une très grande diversité génétique des SIVsmm au Libéria, en Sierra Leone et en Côte d’Ivoire. Une très grande diversité génétique est aussi observée parmi les souches VIH-2, constitué d’au moins huit groupes viraux (notés de A à H), correspondant à huit transmissions inter-espèces indépendantes. Un nouveau variant VIH-2 a été décrit chez un enfant vivant dans la forêt de Tai en Côte d’Ivoire et pourrait correspondre à une neuvième transmission inter-espèce (Martine Peeters et Marie Laure Chaix, 2013). La plupart des groupes (C à H) n’infectent que peu d’individus et ont été décrits essentiellement dans les zones rurales, où les habitants vivent au contact de ces animaux (chasse ou domestication).
Seuls les groupes A et B ont connu une diffusion épidémique en Afrique de l’Ouest. La Guinée-Bissau est l’épicentre du VIH-2 A, le groupe prédominant, qui circule dans de nombreux pays d’Afrique de l’Ouest (Sénégal, Mali, Nigéria, Burkina Faso, Gambie, Côte d’Ivoire, etc.) ainsi qu’en Europe et, plus particulièrement, en France ou au Portugal qui possèdent des liens historiques avec ces pays. Le VIH-2 groupe B est moins prévalant et circule essentiellement en Côte d’Ivoire et au Ghana. Les ancêtres de ces deux groupes viraux ont été identifiés chez des mangabés enfumés sauvages de la forêt de Tai, en Côte d’Ivoire, proche de la frontière avec le Libéria. Les analyses de datation estiment que l’émergence du VIH-2 a eu lieu vers 1932 pour le groupe A (1906-1955) et 1935 pour le groupe B (1907-1961). L’épidémie de VIH-2 est limitée à l’Afrique de l’Ouest avec les prévalences les plus élevées au Sud du Sénégal (Casamance) et en Guinée-Bissau. En général, les prévalences sont restées faibles, avec une décroissance au cours du temps. Le VIH-2 est moins pathogène et moins transmissible que le virus pandémique, VIH-1 M. Le risque de transmission mère-enfant est très faible (< 2 %) et la transmission sexuelle moins efficace certainement du fait de faibles charges virales. (Martine Peeters et Marie Laure Chaix, 2013).

Morphologie, Structure et Organisation génomique

Morphologie et structure

Il comprend de l’extérieur vers l’intérieur (Figure 1) :
– Enveloppe : une bicouche lipidique dérivant de la membrane de la cellule hôte, contient deux glycoprotéines virales majeur, la glycoprotéine de surface (SU gp120) et la glycoprotéine transmembranaire (TM gp41). Ces deux protéines proviennent du clivage enzymatique de la pré-protéine gp160. L’enveloppe contient également plusieurs protéines membranaires dérivées de la cellule hôte, les antigènes du CMH, l’actine et l’ubiquitine.
– La protéine matrice, principalement constituée de la protéine Gag p17 (MA gp17) est ancrée à la face interne de l’enveloppe, elle comprend approximativement 2000 copies codées par le gène gag.
– La partie centrale du virion est occupée par le core (capside), constitué de la protéine CA, p24 d’environ 2000 copies, elle renferme deux ARN simple brin, linéaire, de polarité positive, d’environ 9,5kb, stabilisé par la protéine nucleocapsidique (NC, P7) avec laquelle elle forme un complexe ribonucléoprotéique ; elle contient également trois enzymes virales essentielle : la protéase, la transcriptase inverse et l’intégrase.
Figure 1 : Structure du VIH-1 (Tiré du traité de virologie médicale Pr J-M Huraux, 2003)

Organisation génomique

Le génome du VIH mesure environ 10 000 paires de base (pb) et il est composé de 9 cadres ouverts de lectures (Figure 2). Dans le sens 5’ vers 3’, il possède les trois gènes de structures communs à tous les rétrovirus : gag (pour antigène spécifique de groupe), pol (pour polymérase) et env (enveloppe). Il possède également deux gènes régulateurs (tat et rev), et quatre gènes accessoires (nef, vif, vpr et vpu pour le VIH-1 ou vpx pour le VIH-2). Les extrémités du génome du VIH sont flanquées par deux longues séquences terminales répétées (LTR, Long terminal Repeat en anglais) d’environ 650 pb. Elles sont identiquement composées des régions uniques en 5’ (U5) et 3’ (U3), qui encadrent la région (LTR, Long terminal Repeat en anglais) (Krebs et al., 2013).
Elles permettent l’intégration de l’ADN viral dans le génome de la cellule hôte.
Le LTR en 5’ sert de promoteur pour la transcription virale tandis que le LTR en 3’ sert de signal de fin transcriptionnel. LTR en 3’ active aussi la transcription de nef.
Figure 2 : Organisation génomique de VIH-1 et VIH-2 (www.magazinescience.com dernière mise à jour 03/12/2018).

Gènes de structure du VIH : gag, pol et env.

Le gène gag (environ 1 500 pb) code pour un précurseur polyprotéique Gag de 55 kDa (Pr55 Gag) (Freed, 2015). Les protéines de structures du VIH sont générées grâce au clivage de Pr55 Gag par la protéase virale, dans l’ordre des extrémités N-terminale vers C-terminale suivant : protéine de matrice (p17, MA), protéine de capside (p24, CA), peptide d’espace SP1, protéine de nucléocapside (p7, NC), peptide d’espace SP2, et protéine p6 résultante du clivage. Ces protéines interviennent dans l’assemblage, le bourgeonnement et la maturation du virus. Brièvement, MA permet l’adressage et la liaison de Pr55 Gag à la membrane plasmatique cellulaire où a lieu l’assemblage (Jouvenet et al., 2006), ainsi que l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe. CA guide la multimérisation de Pr55 Gag au cours de l’assemblage, et elle participe aussi à la formation de la capside. SP1 et NC interviennent aussi dans l’assemblage de Pr55 Gag. De plus, NC participe au recrutement et à l’encapsidation de l’ARN viral. Enfin, p6 recrute le complexe protéique ESRT (Endosomal sorting complex required for transport, en anglais) qui catalyse la fission de la membrane cellulaire et permet la libération du virion immature (Carlton and Martin-Serrano, 2007).
En association avec le gène pol (environ 3 000 pb), le gène gag peut aussi coder pour le précurseur polyprotéique Gag-Pol de 160 kDa (Pr160 Gag-Pol) (Freed, 2015). Le clivage de Pr160 Gag-Pol par la protéase (N-terminale vers C-terminale), génère Pr55 Gag ainsi que les trois protéines enzymatiques du VIH : protéase (p11, PR), rétro-transcriptase (p66/p51, RT), intégrase (p32, IN). Brièvement, PR permet le clivage de Pr55 Gag et Pr160 Gag-Pol au cours de la maturation du virus. L’inactivité de la protéase conduit à la production de particules virales immatures non infectieuses. RT converti l’ARN viral monocaténaire en ADN bicaténaire après son entrée dans la cellule. IN permet l’insertion de l’ADN néo-synthétisé dans le génome de la cellule hôte.
Le gène env (environ 2 500 pb) code pour le précurseur glycoprotéique 160 (gp160).
La gp160 est ensuite clivée par une protéase cellulaire en une glycoprotéine de surface 120 (gp120, SU) et en une glycoprotéine transmembranaire 41 (gp41, TM). La gp120, composée de 5 régions conservées (C1-C5) et 5 domaines hypervariables (V1-V5), qui forment des boucles à leur base et contiennent les sites de liaison pour le récepteur CD4 et co-récepteurs des chémokines (CCR5 ou CXCR4) (Wilen et al., 2012). Les glycoprotéines gp120 et gp41 sont donc impliquées dans l’attachement, la fusion et la cytolyse au cours de l’entrée du virus dans la cellule.

Gènes régulateurs et accessoires du VIH :

Les gènes régulateurs tat et rev codent respectivement pour la protéine trans-activatrice (tat) et la protéine régulatrice de l’expression du VIH (rev) (Adamson and Freed, 2010; Goodsell, 2012). A l’intérieur de la capside, tat active l’élongation en se liant à la région TAR (Transactivation response region, en anglais) de l’ARNm (Karn and Graeble, 1992). rev joue un rôle majeur dans le transport de l’ARNm viral du noyau vers le cytoplasme et il régule négativement l’expression de tat, rev et nef.
Les gènes accessoires ne sont pas essentiels à la réplication virale, contrairement aux gènes régulateurs. Les gènes vif, vpr, vpu (ou vpx pour le VIH-2) et nef codent respectivement pour le facteur d’infectivité virale (vif), les protéines virales R (vpr) ou X (vpx, pour le VIH-2) et U (vpu), ainsi que le facteur négatif (nef). Brièvement, dans le cytoplasme, Vif augmente significativement l’infectivité du virus, tandis que vpr facilite notamment l’import du complexe de pré-intégration (CPI) viral du cytoplasme de la cellule hôte vers le noyau. Dans l’enveloppe, nef augmente notamment la réplication et la pathogénicité du virus, tandis que vpu (ou vpx pour le VIH-2) active le relargage des virions immatures et induit la dégradation des CD4.

Cycle de réplication virale :

Le VIH est un rétrovirus qui a besoin d’intégrer le noyau de la cellule infectée pour détourner le fonctionnement cellulaire afin d’assurer sa réplication.
L’infection virale peut être découpée en plusieurs étapes majeures correspondant à la phase précoce du cycle de réplication du virus et aboutissant à la formation de nouveaux virions (Rothe et al., 1996).
– L’attachement (figure 3) du virus à la cellule hôte se fait par interaction spécifique entre la gp120 et son récepteur, la molécule CD4 (Weiss, 1993). Cette fixation induit des changements conformationnels permettant la reconnaissance de la gp120 par les co-récepteurs (D’Souza et al., 1996). Il y’a alors fusion entre la membrane virale et la membrane cytoplasmique cellulaire.
– La Décapsidation et transcription inverse (figure 4) : Au cours de cet évènement, le virus est progressivement et partiellement désassemblé dans le cytoplasme. C’est à partir des complexes obtenus qu’a lieu dans le cytoplasme la transcription inverse du génome viral. Grace à un ARNt lysine comme amorce, la RT synthétise un brin d’ADN complémentaire de l’ARN viral et génère à chaque extrémité du génome de longues répétitions terminales identiques (Long Terminal Repeats, LTR). La RNAse H dégrade le brin d’ARN pendant qu’un deuxième brin d’ADN est constitué. Le génome viral s’associe avec des protéines cellulaires et virales en un complexe nucléoprotéique, le complexe de pré-intégration.
Figure 4 : schéma de la transcription inverse
[http://georges.dolisi.free.fr/Schemas/VIH.gif]
dernière mise à jour le 03/02/2016
– L’import nucléaire, intégration (figure 5) : Après la transcription inverse, le génome viral est acheminé au noyau de la cellule. A la suite de l’import du complexe de pré-intégration au noyau, l’ADN viral est intégré dans l’ADN chromosomique de la cellule infectée par l’action de l’intégrase virale. Le virus est alors sous sa forme de provirus.
Figure 5 : schéma de l’entrée de l’ADN dans le noyau (5a) et de son intégration (5b) [http://georges.dolisi.free.fr/Schemas/VIH.gif] dernière mise à jour le 03/02/2016jour le 03/02/2016
– Transcription et traduction (figure 6) : partir du promoteur viral situé en 5’ du LTR, les copies intégrées d’ADN du VIH-1 servent de matrice pour la synthèse d’ARN messagers viraux grâce à l’ARN polymérase II et les interactions coordonnées de la protéine Tat et des facteurs de la transcription
Figure 6 : schéma de la transcription (6a) et de la traduction (6b) du génome viral [http://georges.dolisi.free.fr/Schemas/VIH.gif] dernière mise à jour le 03/02/2016
– L’Assemblage et le bourgeonnement (figure 7) : Les poly-protéines Pr55Gag et Pr160Gag-Pol, en association avec les protéines accessoires (vif, vpr, nef) et le génome viral nouvellement synthétisé, se regroupent à la membrane puis s’assemblent avec les protéines de l’enveloppe, la gp120 et la gp41. C’est le vpu qui stimule la relâche des nouvelles particules virales. La protéase virale clive les précurseurs protéiques Pr55Gag et Pr160Gag-Pol et la capside se condense puis adopte sa forme caractéristique en cône.
Le virus peut alors entamer un nouveau cycle de réplication.
Figure 7 : assemblage (7a) et bourgeonnement (7b) des nouveaux virions [http://georges.dolisi.free.fr/Schemas/VIH.gif] dernière mise à jour le 03/02/2016

Diagnostic biologique et suivi immuno-virologique de l’infection :

Les méthodes de dépistage de référence sont actuellement les méthodes immuno-enzymatiques de type « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay » (ELISA) combiné de 4e génération. La majorité des trousses détecte les IgM et IgG anti-VIH-1/2 à l’aide d’antigènes qui sont des protéines recombinantes. La détection supplémentaire de l’antigène p24 dans ces tests permet un dépistage plus précoce de quelques jours au cours de la primo-infection (environ trois semaines après la transmission du virus).
On peut également effectuer une recherche isolée de l’antigène p24 (positive en 15 jours) ou du génome viral dans le plasma (positive en 10 jours) en cas de suspicion de primo-infection. Les tests dits « rapides » sont facilement réalisables mais n’ont pas le même niveau de sensibilité que les tests ELISA combinés au cours de la phase aiguë. Ces tests font appel à une agglutination ou à une adsorption du complexe antigène-anticorps sur une membrane, suivie d’une coloration visible à l’œil nu.
De par le risque de faux positifs avec ces tests (facteurs rhumatoïdes, anticorps antinucléaires), une technique de confirmation est nécessaire en cas de positivité ou de doute. La technique de référence est le Western-Blot : des protéines virales sont séparées par électrophorèse puis transférées sur membrane de nitrocellulose. La présence d’anticorps contre une protéine donnée est révélée par une réaction immuno-enzymatique, qui matérialise la position de la protéine sous la forme d’une bande colorée. Les critères de positivité sont ceux de l’OMS et consistent en la présence d’anticorps dirigés contre au moins deux des glycoprotéines d’enveloppe pour le VIH-1, et d’anticorps dirigés contre au moins une glycoprotéine d’enveloppe, une protéine codée par gag et une protéine codée par pol pour le VIH-2. Un des intérêts de ce test est de soupçonner des cas de primo-infection sur la base de profils incomplets, notamment lorsqu’est observée une réactivité contre les protéines gp160 et p24.
Toute positivité sur ce premier test de discrimination doit être confirmée sur un second prélèvement de sérum pour s’affranchir d’un problème d’identité et poser définitivement le diagnostic d’infection par le VIH.
La mesure de la charge virale plasmatique (CV) par amplification génique (RT-PCR en temps réel : « Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ») permet d’évaluer et de suivre la réplication du virus, en nombre de copies d’ARN viral par millilitre de plasma.
Une variation est significative si elle atteint un facteur 3 (0.5 log10). Il est recommandé de suivre un patient avec la même technique de CV, et si possible dans le même laboratoire.
Le deuxième paramètre clef du suivi de l’infection par le VIH est le nombre de lymphocytes T CD4+, reflet de l’état immunitaire du patient (figure 8). L’amplification de l’ADN proviral par PCR consiste à mettre en évidence le génome viral dans la cellule. La recherche de l’ADN proviral, ajoutée à la mesure de la CV plasmatique, se révèle utile pour le diagnostic de l’infection de l’enfant né de mère séropositive, pour exclure la contamination de celui-ci. Actuellement, la culture virale (sur cellules MT2, Sup T1) n’est effectuée qu’à des fins de recherche. Elle peut rester intéressante en cas de virus variants non reconnus par les techniques moléculaires.

Table des matières

INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : GENERALITES SUR L’INFECTION A VIH
I. RAPPELS SUR LE VIH
1. Définition et classification du VIH
2. Origines du VIH
3. Morphologie, Structure et Organisation génomique
3.1. Morphologie et structure
3.2. Organisation génomique
3.2.1. Gènes de structure du VIH : gag, pol et env
3.2.2. Gènes régulateurs et accessoires du VIH
4. Cycle de réplication virale
5. Diagnostic biologique et suivi immuno-virologique de l’infection
II. DIVERSITE GENETIQUE
III. TRAITEMENT ANTIRETROVIRAL ET RESISTANCE DU VIH AUX ARV
1. Classe et mécanismes d’action des ARV
1.1. Inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse (INTIs)
1.2. Inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTIs)
1.3. Inhibiteurs de la protéase (IPs)
1.4. Inhibiteurs d’entrée
1.5. Inhibiteurs d’intégrase (INIs)
2. Résistance du VIH aux molécules antirétrovirales
2.1. Définition de la notion de résistance
2.2. Mécanismes de résistance et mutations associées
2.2.1. Mécanismes de résistance
2.2.1.1. Mécanismes de résistance aux INTI
2.2.1.2. Mécanismes de résistance aux INNTI
2.2.1.3. Mécanismes de résistance aux IPs
2.2.1.4. Mécanismes de résistance aux INIs
2.2.1.5. Autres mécanismes de résistance
2.2.2. Mutations associées à la résistance aux ARV
3. Analyse et interprétation de la résistance
3.1. Généralités sur les tests de résistance
3.2. Interprétation des mutations de résistance :
DEUXIEME PARTIE : NOTRE ETUDE
I. METHODOLOGIE
1.1. Cadre, population de l’étude et critères de sélection des participants
1.1.1. Cadre de l’étude
1.1.2. Population d’étude
Par rapport aux critères de sélection des participants
1.2. Prélèvements et Conservation
1.3. Taille des échantillons
1.4. Analyses au laboratoire
1.4.1. Quantification de l’ARN viral du VIH
1.4.2. Tests génotypiques de résistance
1.4.2.1. Extraction de l’ARN viral
1.4.2.2. Amplification de l’ADN viral
1.4.2.3. Purification
1.4.2.4. Analyse des données de séquençage
1.4.2.4.1. Principe du séquençage
1.4.2.4.2. Correction et analyse des séquences
1.4.2.4.3. Alignement des séquences et la phylogénie
1.4.3. Analyses statistiques des données
II. RÉSULTATS
1. Caractéristiques démographiques de la population d’étude
2. La charge virale
3. Génotypage de résistance
III. DISCUSSION
1. Population d’étude
2. La charge virale
3. Génotypage de résistance
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
REFERENCES