Modélisation de la néphropathie à IgA

 Modélisation de la néphropathie à IgA

Les traitements des souris

Au total neuf protocoles ont été utilisés. Ils sont résumés dans les figures 3 supp page 99 et 4 supp page 100. L’hybridome produisant l’IgG1 murine anti IgA1 et IgA2 humaines, clone CH-EB6, a été acheté chez ATCC et cloné puis sous-cloné au laboratoire de façon à le stabiliser. Le clone 4.2 a été cultivé en grande quantité et l’IgG1 murine purifiée sur colonne d’affinité à partir du surnageant de culture. Vingt ou quarante microgrammes ont été injectés 4 fois par voie s.c. (protocole 2). L’adriamycine (Sigma Aldrich) a été injectée 4 fois en i.v. à 1 g/g souris (protocole 4). Après avoir été tué par la chaleur, un million de bactéries Escherichia coli préparé au laboratoire a été injecté 4 fois par la voie i.t. (protocole 5). Le LPS de la souche Escherichia coli O111 : B4 (Invivogen) a été injecté 4 fois en i.t. à 10 g/souris ou 4 ou 8 fois en i.p. à 1,3, 2,5, 3,3, 6,5 ou 13 g/g souris (protocoles 6, 7, κ et λ). L’IgA polyclonale humaine provient d’un mélange d’IgA purifiées sur colonne d’affinité à partir des plasmas de volontaires sains. Quatre-cent microgrammes d’IgA ont été injectées en i.v. dans les protocoles 8 et 9 46h après la dernière injection de LPS et 2h avant les prélèvements. Pour tous ces protocoles, du sérum physiologique a été utilisé comme diluant et le même volume que l’IgG1 monoclonale murine, l’adriamycine, les bactéries, le LPS ou l’IgA polyclonale humaine a été injecté aux souris contrôle. Dans le protocole 6, le régime alimentaire spécifique riche en sel et en protéines animales (Dietex) a été donné aux souris une semaine avant qu’elles ne subissent une ablation d’un rein ou une opération fantôme. Les souris ont ensuite été laissées tranquilles pendant 1 mois de façon à ce qu’elles récupèrent, avant de démarrer la série d’injections de LPS. Pendant toute la durée du protocole, les souris n’ont eu que les granulés spécifiques qui ont été donnés ad libitum. Anderson Archelus | Thèse de doctorat | Université de Limoges 100 La gliadine a été dissoute dans l’éthanol et mise à la concentration finale de 1 mg/mL dans l’eau de boisson. L’eau de boisson contenant la gliadine ou uniquement l’éthanol a été renouvelée tous les 7 jours pendant 14 semaines (protocole 3).

Prélèvements

Le sang a été prélevé sur héparine par voie rétro-orbitale puis centrifugé et le plasma a été congelé à -20°C. La semaine précédant le premier recueil d’urine, les souris ont été placées une demijournée en cage métabolique pour les habituer. Pour le recueil d’urine, c’est l’urine de 24 h qui a été recupérée sur glace, en sortie de cage métabolique ; dans chaque cage métabolique n’a été placée qu’une souris à la fois. L’hématurie a été évaluée directement sur l’urine fraîche puis la moitié a été centrifugée et le surnageant congelé à -20°C. L’autre moitié a été mélangé à un volume équivalent d’eau de façon à lyser les éventuels globules rouges puis après 10 min à température ambiante, le mélange a été centrifugé et le surnageant congelé à -20°C. Chaque rein a été coupé en deux ; la moitié de chaque rein a été placée dans une cupule contenant le liquide de congélation OCT (Sakura) et mis à congeler sur la carboglace puis conservé à -κ0°C. L’autre moitié de chaque rein a été incubée dans une solution de paraformaldéhyde à 4% dans du tampon phosphate, laissée 24 h dans le fixateur à température ambiante puis placée dans du tampon phosphate avant d’être déposée sur le plateau d’histologie de la plateforme BISCEm pour y être enrobée en paraffine, coupée et colorée avec le PAS. 

Mesure des Ig circulantes

Les IgM murines, les IgA chimériques humaines, les IgG chimériques humaines, les complexes IgA chimériques humaines-IgG chimériques humaines, les IgG1 murines, les complexes IgA chimériques humaines-IgG1 murines et les IgA polyclonales humaines circulantes ont été dosées par des ELISA faits maison avec des anticorps primaires non conjugués et des anticorps secondaires couplés à la phosphatase alcaline (Southern Biotech et Beckman Coulter). Les Anderson Archelus | Thèse de doctorat | Université de Limoges 102 gammes étalon ont été faites avec des standards d’Ig murines (Southern Biotech) ou des dilutions d’un plasma humain de concentration connue pour les différentes classes d’Ig circulantes. Dosage de l’hématurie Un comptage des hématies a été fait au microscope avec quelques microlitres d’urine déposés dans un hématimètre appelé Kovaslide (Hycor). Dans l’urine des souris, les hématies peuvent se confondre avec des saletés. Pour vérifier certains comptages douteux, l’hémoglobine a été mesurée par un ELISA commercial (Abcam) sur l’urine mélangée à l’eau. Mesure de la protéinurie La protéinurie totale et l’albuminurie ont été évaluées. La protéinurie totale a été quantifiée par un dosage colorimétrique avec le kit BCA (Pierce) et en utilisant une gamme d’albumine sérique bovine. L’albuminurie a été mesurée par western blot avec un anticorps anti-albumine murine (Abcam) révélé par chimioluminescence. La quantité dans l’urine a été évaluée en comparaison d’une gamme d’albumine sérique murine déposée sur le même gel d’électrophorèse que les échantillons à analyser. Quantification de la créatinine La créatinine urinaire a été dosée avec le kit colorimétrique commercial creatinin parameter assay (R&D systems) qui utilise la réaction de Jaffe. La créatininémie a été mesurée avec un kit commercial de chez ThermoScientific pour l’automate Konelab

Mesure des dépôts mésangiaux 

Les reins congelés ont été coupés au cryostat en sections de 8 m d’épaisseur qui ont été séchées et congelées à -κ0°C avant d’être marquées par immunofluorescence en utilisant les anticorps suivants : anti-IgA humaine conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (Southern Biotech), anti-IgG humaine conjugué à l’AlexaFluor4κκ (ThermoFisher – Invitrogen), anti-IgG murine conjugué à l’AlexaFluor4κκ (Invitrogen), anti-C3 murin (Abcam) révélé par un anticorps secondaire, et antipodocine (Sigma). L’anti-podocine a été marqué au laboratoire par l’AlexaFluor546 à l’aide d’un kit de conjugaison (ThermoFisher – Molecular Probes) et a été utilisé pour détecter les podocytes et ainsi délimiter le mésangium. Les coupes ont été aussi marquées avec le fluorochrome nucléaire, le 4’,6’-diamidino-2-phénylindole. Elles ont été examinées sous microscope à épifluorescence (Nikon ; plateau de microscopie de la plateforme universitaire BISCEm). L’intensité du marquage a été semiquantifiée par un système de score où 0 représente une absence de marquage dans 1 glomérule et 3 un marquage de forte intensité équivalent à celui d’une lame référence positive. L’intensité du marquage a été évaluée pour 10 glomérules par coupe et les résultats sont exprimés en intensité moyenne par glomérule. Anderson Archelus | Thèse de doctorat | Université de Limoges 103 Analyse des lésions rénales Les coupes colorées au PAS ont été examinées pour une recherche globale de lésions rénales (atrophie tubulaire, infiltration cellulaire, cylindres,…) mais seuls deux paramètres ont été quantifiés sur 20 glomérules par rein : la cellularité glomérulaire et la glomérulosclérose. Les lames ont d’abord été scannées (Hamamatsu). La cellularité glomérulaire a été quantifiée en comptant le nombre de noyaux par unité de surface, calculée à l’aide du logiciel d’analyse d’image Volocity (Perkin Elmer). La glomérulosclérose a été semi-quantifiée par un système de score où 0 indique une matrice extracellulaire, colorée en rose fushia avec le PAS, de taille normale et 2 correspond à une matrice très étendue par rapport à la normale. Statistiques Les expériences ont toutes été réalisées avec un nombre minimal de 3 animaux contrôle et de 4 animaux traités. Les résultats sont présentés sous forme de moyennes +/- erreur standard à la moyenne. Les valeurs ont été transformées en log pour être analysées par des tests statistiques appropriés : test de t de Student ou analyse de variance avec la correction de Bonferroni. P< 0,05 est considéré comme statistiquement significatif. Contributions Différentes personnes ont contribué à la réalisation de ces expériences : D ARNAUD, M THOMAS, T DENIS et Z GOUDA pendant leur stage de M1, Z ORUC du laboratoire, qui a initié la comparaison des souris 1KI et 1KI (protocole 1) et C OBLET, aussi du laboratoire, qui a purifié l’IgG1 murine anti-IgA humaine (protocole 2) et les IgA polyclonales humaines (protocoles 8 et 9).