MISE EN PLACE ET EVALUATION D’UNE PCR MULTIP LEX EN TEMP S R EEL D ES P R I NC I P A LES HELMI N THIASES EN GUYANE FRANÇAISE

Mise en place de la qPCR multiplexe à visée du diagnostic des helminthiases

Choix de la méthode qPCR Nous avons utilisé une qPCR multiplex avec les amorces et sondes décrites dans l’article de Basuni et al. de 2011 (16). Le choix de cette technique a porté sur ses performances techniques avec une sensibilité de 67,3 % et une spécificité de 100 % (11,12) et sur son adéquation à répondre à nos besoins, les quatre espèces d’helminthes détectées étant les plus fréquemment retrouvées dans la région guyanaise. Sa sensibilité a été définie avec une détection de 10 copies pour Ancylostoma duodenale, Ascaris lumbricoides et Strongyloides stercoralis et de 10^3 copies pour Necator americanus.

Technique d’extraction

Pour procéder à l’extraction d’ADN des échantillons de selles, nous avons utilisé l’automate QIAsymphonySP/AS (Qiagen®) (annexe 4) avec le kit DNA tissue de QIAGEN® utilisable pour de grands volumes d’échantillons. Il s’agit d’une technique automatisable utilisant le principe des billes magnétiques et présentant un bon rendement : il est possible d’extraire un nombre important de selles en un temps très court comparativement à la technique d’extraction manuelle Power fecal DNA isolation Kit (Mobio®). Celle-ci utilise une technique de purification par membrane de silice considérée comme technique de référence. Les caractéristiques respectives de ces deux techniques sont résumées dans le tableau 5. 64 Tableau 5 : Comparaison des deux méthodes d’extraction QIASymphony SP/AS (Qiagen®) et Power fecal DNA isolation Kil (Mobio®

Prétraitement des échantillons

Ce protocole d’extraction nécessite un pré-traitement manuel préalable permettant une lyse mécanique des éléments cellulaires contenus dans les échantillons : œufs, larves et adultes de parasites. Après décongélation ou sur selles fraîches, une noisette de selles préalablement homogénéisée est transvasée dans un tube de 2mL contenant des billes de céramique 1.4mm Rnase/Dnases free. Ce tube est ensuite vortexé pendant une durée de 10 minutes. Les échantillons lysés et homogénéisés sont alors centrifugés pendant 10 minutes à 13 000 rpm. Le surnageant de l’échantillon est isolé à l’aide d’une pipette Pasteur et incorporé dans l’automate pour effectuer la phase d’extraction automatisée d’une durée de 90 minutes pour un portoir de 24 échantillons. L’ADN purifié ainsi obtenu peut être conservé à une température de 2 à 8 °C pendant une durée maximale de 5 jours. Le fabricant préconise une température de –20 °C ou de –80°C pour un stockage à long terme.