Microscopie de fluorescence par excitation à deux photons

Problèmes rencontrés lors de l’excitation d’une molécule :

photo-blanchiment, photo-dégradation, saturation, effets thermiques. Suite à son irradiation, une molécule à l’état excité a tendance à être plus réactive d’un point de vue chimique que dans son état fondamental [Rost 1992]. Des réactions irréversibles (polymérisations, oxydations, dissociations, isomérisations, liaisons avec d’autres molécules) peuvent se produire et donner naissance à des photo-produits. Ces nouvelles espèces créées sont souvent non fluorescentes ou caractérisées par des spectres d’absorption et d’émission de fluorescence différents de ceux de la molécule initiale. Ces réactions photo-chimiques se traduisent par une perte progressive de l’intensité de fluorescence émise par un échantillon. Cet effet est appelé processus de photo-blanchiment. Certaines espèces peuvent par ailleurs avoir une influence néfaste sur un milieu biologique vivant. On parle alors de photo-toxicité. Un autre problème rencontré lors de l’excitation d’une molécule par un rayonnement intense est la saturation de l’état excité.

Ce processus n’est pas en lui-même nécessairement destructif pour la molécule considérée. La variation de l’intensité de fluorescence émise dans des conditions de saturation ne varie plus linéairement avec l’énergie incidente et peut ainsi conduire à des erreurs d’interprétations des résultats obtenus. D’autre part, les effets de photoblanchiment et de photo-dégradation seront d’autant plus importants que l’intensité incidente sera élevée. Finalement, l’excitation d’une molécule par un rayonnement intense est à l’origine d’effets thermiques. Ces échauffements sont dépendants des capacités d’absorption des molécules et sont générés lors des différents processus de conversion interne. Ils ont évidement un effet destructif sur la molécule et son environnement. Ces effets pourront être limités par diminution de l’intensité incidente. L’excitation de la fluorescence d’une molécule par une radiation lumineuse peut donc conduire à une dégradation progressive plus ou moins rapide des molécules absorbantes et de leur environnement local. Ces processus de photo-dégradation dépendent des densités d’énergie incidente mais aussi des fluorophores utilisés et de la durée de l’irradiation. Les conditions d’excitation de la fluorescence sont donc à déterminer précisément de manière à s’affranchir le plus possible de ces effets.

Le microscope confocal de fluorescence : principe, performances et inconvénients.

Au cours du vingtième siècle, les méthodes d’analyse de la fluorescence, alliées aux techniques de microscopie, sont devenues un moyen d’étude très puissant en biologie. La microscopie de fluorescence permet en effet la détection in-vivo de particules et de structures qui ne peuvent être visualisées en microscopie optique conventionnelle et révèle les processus métaboliques au sein de la cellule. Plusieurs techniques de microscopie de fluorescence, basée sur une excitation monophotonique (dans le domaine du visible ou de l’ultraviolet), ont été développées dans ce but d’exploration d’entités biologiques :

– la microscopie de fluorescence classique par transmission : l’échantillon est entièrement illuminé par le faisceau excitateur. Le signal de fluorescence émis et transmis par l’échantillon est collecté par l’objectif de microscope. Cette méthode est peu utilisée en raison d’inconvénients majeurs. Comme on collecte le signal de fluorescence transmis à travers l’échantillon, on est ici limité à l’étude d’échantillons extrêmement fins. Par ailleurs, un signal donné par la lumière excitatrice transmise viens s’ajouter au signal de fluorescence de l’échantillon dégradant la qualité du signal final. D’autre part, cette technique est caractérisée par une mauvaise résolution axiale. En effet, bien que la mise au point se fasse sur un plan focal précis, l’enregistrement de l’information est entaché d’un bruit de fond considérable qui se superpose à l’image du plan observé. Ce bruit résulte entre autre de l’excitation, par la source lumineuse, de tous les fluorophores situés sur le trajet du faisceau,

– la microscopie à épi-fluorescence : dans ce cas, la lumière excitatrice arrive au travers de l’objectif de microscope qui sert aussi à la collection de la fluorescence émise. Comme le mode de fonctionnement de ce type de microscope n’est plus en transmission, il est permis d’utiliser des échantillons plus épais. Toutefois, en raison des coefficients d’absorption élevés des composants biologiques dans les gammes de longueurs d’onde utilisées, il n’est possible d’étudier qu’une surface d’épaisseur limitée des échantillons. Comparé au cas du microscope de fluorescence par transmission, le signal détecté n’est plus perturbé par la lumière excitatrice. Cependant, les problèmes de résolution axiale subsistent,

– la microscopie confocale de fluorescence : cette technique est basée sur le microscope à épi-fluorescence sur lequel on a rajouté un trou de filtrage servant à bloquer tout signal ne provenant pas du plan focal. En raison de ses capacités de résolution tridimensionnelle, la microscopie confocale fut à l’origine d’améliorations considérables en microscopie de fluorescence. Nous décrirons ici en détail le principe, les performances et les limitations de cette technique.

Problèmes rencontrés en microscopie confocale de fluorescence.

Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission étant très proches, il est difficile de trouver un miroir dichroïque ayant une réflectivité maximale pour la longueur d’onde d’excitation et une transmission optimale pour la longueur d’onde de fluorescence, ce qui induit des pertes considérables de l’intensité de fluorescence détectée. Des pertes supplémentaires sont dues à l’utilisation du trou de filtrage. La taille du trou doit être judicieusement choisie (diamètre proche de la valeur Φmax) et l’alignement du montage doit être parfaitement réalisé afin de minimiser ces pertes. Le microscope confocal nécessite l’emploi d’éléments optiques spécialement conçus pour l’ultraviolet permettant à la fois une transmission optimale de la lumière excitatrice avec une limitation des aberrations et une collection efficace de la lumière de fluorescence. Ce type d’objectif est relativement coûteux. La fluorescence « parasite » émise par les plans inférieurs et supérieurs au plan de focalisation, ainsi que la lumière diffusée, constituent une source de bruit importante malgré l’utilisation du trou de filtrage.

L’intensité d’une onde électromagnétique se propageant dans un milieu absorbant décroit exponentiellement suivant la loi de Beer-Lambert : I = I0 exp(-εz), où I0 est l’intensité initiale, ε le coefficient d’extinction molaire et z la distance parcourue dans le milieu. La plupart des composants biologiques ont des coefficients d’absorption élevés dans le domaine du visible et de l’ultraviolet, ainsi la profondeur de pénétration dans des échantillons biologiques est très limitée (<50 μm). Le problème majeur lié à cette configuration est la dégradation très rapide des échantillons biologiques vivants sous un mode d’excitation monophotonique (photo-toxicité, photoblanchiment, saturation, échauffement…). En effet, en raison des forts coefficients d’absorption des constituants biologiques dans le domaine du visible et de l’ultraviolet, l’absorption et donc les photo-dommages ont lieu sur tout le trajet du faisceau, donc même en dehors de la zone d’étude. La majorité de ces problèmes pourront être résolus par l’utilisation de la technique de microscopie de fluorescence par excitation à deux photons. Avant de décrire cette nouvelle technique, nous introduirons les bases physiques du processus non linéaire d’absorption à deux photons et les propriétés du signal de fluorescence émis suite à une telle excitation.

(4) Dégradation des échantillons réduite. Le principal avantage du microscope de fluorescence par EDP est la restriction des éventuels dommages au point de focalisation, due à la localisation de l’excitation. Les divers problèmes exposés au paragraphe I.1.1.6 rencontrés lors de l’excitation d’une molécule : effets thermiques, photo-blanchiment, création de photo-produits, photo-dégradation seront ainsi limités au micro-volume de focalisation. Ceci constitue déjà un avantage non négligeable en comparaison de la microscopie confocale. Cependant il reste à étudier dans quelles mesures l’EDP n’est pas localement plus destructrice en raison des très fortes densités de puissance utilisées en régime femtoseconde à haute cadence (puissance crête de l’ordre du TW/cm2). Les dommages causés suite à une EDP sont difficiles à estimer, ceux-ci dépendant de nombreux paramètres tels que la concentration et le type de fluorophore utilisé, la longueur d’onde et la densité de puissance incidente, et bien sûr le type d’échantillon étudié. Peu d’études systématiques ont été publiées dans ce contexte. Il existe tout de même quelques études quantitatives complètes des dommages induits par une excitation multiphotonique définissant les paramètres à contrôler pour des applications particulières telles que l’imagerie de fluorescence de l’activité calcique en milieu cellulaire (neurones) [Koester 1999] ou les effets de l’excitation de molécules photosensibles utilisées en thérapie photodynamique sur l’ADN [Shafirovich 1999]. Afin de tenter de préciser ces effets de dommages, nous effectuerons ici une synthèse de divers résultats publiés analysant les problèmes et dégradations causées par une EDP.