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Prélèvement
La technique du prélèvement est un geste primordial qui dépend de l’aspect clinique des lésions et de leur siège. L’ensemble du tégument doit être examiné et chaque lésion différente par son siège ou son aspect clinique sera prélevée individuellement. Une quantité suffisante d’échantillon doit être obtenue pour réaliser l’examen direct et la culture. Toutes les lésions squameuses ou squamo-croûteuses des plis, de la peau glabre sont prélevées par grattage au niveau de la zone active figurée par la bordure extensive. Si les lésions sont suintantes, elles sont prélevées par écouvillonage. Si la lésion est sur une zone pileuse (cuir chevelu, barbe, cuisse…), le grattage est réalisé sur la zone alopécique squameuse ou squamo-croûteuse. En cas d’obtention insuffisante de poils ou de cheveux parasités par grattage, ceux-ci sont prélevés à la pince à épiler. Le prélèvement d’une onychomycose latéro-distale s’effectue à la jonction ongle sain-ongle malade par grattage du matériel friable du lit de l’ongle après découpage de la tablette jusqu’à cette zone. S’il s’agit d’une leuconychie, le prélèvement se fait au sein même de la zone blanche. En cas de périonyxis associé à l’onyxis, un raclage est effectué sous le repli sus-unguéal. Quelle que soit la lésion, s’il y a émission de pus, celui-ci est prélevé avec un écouvillon. Les lésions des muqueuses (bouche, vagin) sont prélevées à l’écouvillon après grattage de la zone atteinte.
En cas de lésion sous-cutanée dermo-hypodermique, seule une biopsie large et profonde est utile et nécessaire pour isoler l’agent fongique. Elle est partagée en deux parties, une pour l’examen mycologique et l’autre pour l’examen anatomopathologique. Ce dernier confirme l’envahissement tissulaire grâce aux colorations spécifiques des champignons: coloration argentique de Gomori-Grocott et coloration par le PAS (periodic acid Schiff). Le diagnostic de pityriasis versicolor se fait par le simple examen direct au microscope d’un ruban adhésif transparent qui a été collé sur la lésion après léger grattage de celle-ci. La culture mycologique n’a aucun intérêt dans ce cas.
L’examen direct du matériel prélevé
Cet examen en visualisant les éléments fongiques présents dans le matériel prélevé confirme le diagnostic d’infection fongique et peut orienter vers un type de mycose, mais il ne permet pas de nommer l’espèce responsable. Après dissociation des squames et fragments d’ongles dans la potasse aqueuse à 30% ou dans une solution de noir chlorazol, entre lame et lamelle, l’examen direct permet de visualiser les filaments septés, réguliers d’un dermatophyte, les filaments septés plus grossiers et irréguliers, formant des vésicules, d’une moisissure, les pseudofilaments et les blastospores d’un Candida. Après éclaircissement des cheveux et des poils dans du chloral-lactophénol, l’examen précise le type du parasitisme pilaire (Fig. 24). Type microscporique (A), microïde (B), mégasporique (C), endothrix et favique (E) Après avoir collé sur une lame le ruban adhésif transparent pour recherche de Malassezia, le diagnostic de pityriasis versicolor pourra être confirmé sur la présence de filaments courts et épais et de blastospores groupées en grappes de raisin (Fig. 18b).
La culture
Elle s’effectue sur les milieux gélosés de Sabouraud avec antibiotiques pour limiter le développement des bactéries et additionnés ou non de cycloheximide pour limiter la pousse de moisissures contaminantes dont la croissance plus rapide gênerait le développement des colonies des champignons habituellement pathogènes. S’il s’agit d’une levure, les colonies sont identifiables en quelques jours. S’il s’agit d’un dermatophyte, le résultat n’est rendu qu’au bout de 3 semaines. Quelques espèces de dermatophytes poussent en 2 semaines, d’autres nécessitent plus de 3 semaines. Si les examens macroscopique et microscopique des colonies ne permettent pas l’identification du champignon, les colonies sont repiquées sur des milieux spéciaux qui favorisent la fructification du champignon ou l’émission d’une pigmentation spécifique.
Identification des cultures
De façon classique, l’identification se base généralement sur les examens macroscopique et microscopique des colonies.
Examen macroscopique des colonies
La vitesse de pousse est déjà une bonne orientation. Elle peut être rapide comme chez les Aspergillus et les Mucorales, plus lente chez les dermatophytes et certaines Dématiés (Phaéohyphomycètes), ou même très lente comme chez Onychocola canadensis, agent d’onychomycose. La vitessse de pousse varie aussi en fonction de la richesse de l’inoculum. Elle est en effet d’autant plus rapide que l’inoculum est important. Les cultures issus du revêtement cutané pousent habituellement bien à 25-30 °C, celles issues de prélèvements profonds à 37 °C. Une atmosphère humide est 51 favorable à la pousse et l’aération des tubes ou des boîtes doit petre correcte (ne pas visser à fond les tubes). L’aspect des colonies est également un bon critère d’orientation. Les champignons levuriformes donne des colonies lisses, glabres, humides, d’aspect brillant ou mat, parfois rugueuses. La démarche diagnostique pour l’identification d’une levure au laboratoire est indiquée sur la figure ci-après (Fig. 25). A l’opposé, les filamenteux ont une texture différente: duveteuse, laineuse, cotonneuse, veloutée, poudreuse ou granuleuse. Parfois certaines colonies de filamenteux peuvent avoir une apparence glabre en raison de l’absence ou de la pauvreté du mycélium aérien. Le relief des colonies (plates, plissés, cérébriformes, …), tout comme leur consistance, est aussi à observer. Elles peuvent en effet être molles, friables, élastiques, cartonnées ou dures. Il convient de préciser aussi la taille des colonies, petites, étendues, voire envahissantes comme chez les Mucorales [15].
La couleur de la colonie est également un élément pertinent d’orientation ainsi que la présence d’un pigment dans la gélose bien que ces derniers critères soient soumis aux conditions de culture. En général, les hyalohyphomycètes restent clairs: colonies blanches, mais aussi crèmes ou colorées (vertes, brunes, orangées, violettes, grises, …). Par contre, les phaéohyphomycètes deviennent rapidement foncés ou noirs. Le pigment et sa couleur, diffusible ou non dans la gélose, doivent être notés. Enfin l’observation macroscopique des cultures devra rechercher en surface, et surtout au centre de la culture, les structures de fructification sexuée (cléistothèces) ou asexuée (pycnides) ainsi que des amas mycéliens ou mèches (corémies).
Table des matières
Remerciements et Dédicaces
Hommages
Illustrations
Introduction
Première partie: Rappels bibliographiques
1. Généralités sur les champignons
1.1. Définitions de champignons et mycoses
1.2. Structures morphologiques
1.2.1 Le thalle végétatif
1.2.2 Le thalle reproducteur
1.2.2.1 La reproduction asexuée (stade anamorphe)
a. La conidiogenèse de type thallique
b. La conidiogenèse de type blastique
1.2.2.2 La reproduction sexuée (stade télémorphe)
1.3. Classification et phylogénie des champignons
2. Les dermatophytes
2.1. Morphologie des dermatophytes
2.2. Origine des dermatophytes
2.3. Manifestations cliniques
2.3.1 Les léions cutanées
2.3.2 Les onychomycoses (tinea unguium)
2.3.3 Les teignes (tinea capitis)
2.3.4 Les dermatophytides
3. Les levures
3.1. Le genre Candida
3.1.1 Morphologie
3.1.2 Écologie des Candida
3.1.3 Tableaux cliniques des Candida
3.1.3.1 Candidoses cutanées
3.1.3.2 Périonyxis et onyxis à Candida
3.1.3.3 Autres candisoses
3.2. Le genre Malassezia
3.2.1 Morphologie
3.2.2 Écologie des Malassezia
3.2.3 Les Malassezioses
3.2.3.1 Pityriasis versicolor
3.2.3.2 La dermite séborrhéique
3.2.3.3 Pityriasis capitis
3.2.3.4 Folliculite du tronc à Malassezia
3.2.3.5 Fongémie à Malassezia
3.3. Autres genres de levures d’intérêt médical
3.3.1 Le genre Cryptococcus.
3.3.2 Le genre Trichosporon
4. Les moisissures
4.1. Le genre Fusarium
4.1.1 Morphologie des Fusarium
4.1.2 Biotope des Fusarium
4.1.3 Fusarioses
4.1.3.1 Fusarioses superficielles
4.1.3.2 Fusarioses profondes ou disséminées
4.2. Autres moisissures
5. Les dimorphiques
5.1. Histoplasma capsulatum var. duboisii
5.1.1 Morphologie
5.1.2 Clinique
6. Méthodes d’identification des champignons
6.1. Méthodes mycologiques conventionnelles.
6.1.1 Prélèvement
6.1.2 L’examen direct du matériel prélevé
6.1.3 La culture
6.1.4 Identification des cultures
6.1.4.1 Examen macroscopique des colonies
6.1.4.2 Examen microscopique des cultures
6.2. La spectrométrie de masse MALDI-TOF
6.2.1 Principe
6.2.2 La matrice
6.2.3 Appareillage: le spectromètre de masse
6.2.4 Processus analytique
6.3. Analyse moléculaire
Deuxième Partie: Travail Expérimental
1. Objectifs spécifiques de l’étude
2. Cadre d’étude
2.1. Le CHU Aristide Le Dantec
2.2. Le laboratoire de Parasitologie-Mycologie du CHU Le Dantec
2.3. L’Institut Hospitalo-Universitaire (IHU) Méditerranée Infection
3. Période et type d’étude
4. Population d’étude
4.1. Critères d’inclusion
4.2. Critères de non inclusion
5. Matériels et Méthodes
5.1. Matériels de l’étude
5.1.1 Matériels classiques de laboratoire
5.1.2 Matériels d’isolement, d’identification et de conservation
5.1.3 Matériels pour MALDI-TOF
5.1.4 Matériels pour l’étude moléculaire (séquençage)
5.2. Méthodes de l’étude
5.2.1 Etude épidémiologique et mycologique.
5.2.1.1 Recueil des données épidémiologiques
5.2.1.2 Méthodes d’isolement et d’identification des champignons au laboratoire de Parasitologie Mycologie du CHU Le Dantec
a. Interrogatoire
b. Prélèvement
c. L’examen direct
d. Culture
e. Préparation des cultures pour l’identification
f. Identification
g. Conservation des souches
5.2.2 Identification des champignons par MALDI-TOF MS
5.2.2.1 Réisolement des souches
5.2.2.2 Préparation de la matrice
5.2.2.3 Préparation des spots
5.2.2.4 Le spectromètre de masse Microflex LT BIOTYPER (BRUKER)®
5.2.2.5 La plaque
5.2.2.6 Acquisitions des données et identifications
5.2.3 Identification des champignons par méthode moléculaire (Séquençage)
5.2.3.1 Extraction de l’ADN
5.2.3.2 PCR d’amplification
5.2.3.3 Détection de l’ADN sur gel d’agarose
5.2.3.4 Purification des produits PCR
5.2.3.5 PCR de séquençage
5.2.3.6 Purification des produits de séquençage et lancement du séquenceur
5.2.3.7 Comparaison des séquences aux banques de données
5.3. Analyse statistique
5.4. Considération éthique
6. Résultats
6.1. Préambule
6.2. Résultats globaux répondant aux objectifs spécifiques (i) et (ii)
6.3. Résultats répondant à l’objectif spécifique (iii)
6.4. Résultats répondant à l’objectif spécifique (iv)
6.5. Résultats supplémentaires
7. Discussion générale
Conclusion
Références
Annexes
