Méthodes de mesure de la prolifération cellulaire in vitro

Marquage par thymidine tritiée

Les essais de lymphoprolifération in vitro par incorporation de thymidine tritiée sont réalisés selon le protocole suivant : les lymphocytes fraîchement isolés (2 x 105 cellules/puit) sont cultivés en présence de 10 µg/ml de PPD et 15 µg/ml de ConA comme témoin positif. Après 4 jours de culture, chaque puit reçoit 1 µCi de thymidine tritiée (Amers-ham). Après 16 heures, les cellules sont transférées sur filtre et le rayonnement β est mesuré à l’aide d’un compteur à scintillation. Les données sont exprimées en Index de stimulation. 

Principe de la cytométrie en flux

La cytométrie en flux, ou FACS (Fluorescence Activated Cell-Sorting) est une technique d’analyse multiparamétrique sur des cellules isolées à partir d’une suspension de populations cellulaires hétérogènes. Les mesures simultanées des caractéristiques physiques et biologiques sont effectuées isolément sur chacune d’entre-elles lorsque, entraînée, à grande vitesse, par un fluide au centre d’une veine liquide, elle traverse la source d’excitation lumineuse (faisceau laser). Après intersection du rayon incident, la cellule diffracte la lumière. L’intensité de la lumière diffractée dans l’axe est proportionnelle à la taille de la cellule (FSC : Forward 44 Méthodes de mesure de la prolifération cellulaire in vitro  Marquage par thymidine tritiée Scatter); celle diffractée à 90° est représentative de son contenu cytoplasmique (SSC : Side Scatter).

Chaque cellule passant devant le faisceau laser peut aussi émettre de la fluorescence à diverses longueurs d’ondes, qui est mesurée à 90° (de 3 à 6 signaux de fluorescence analysés simultanément suivant les appareils). Cette fluorescence peut être naturelle ou le plus souvent résulter de l’incorporation ou de la fixation de sondes spécifiques (fluorochromes, anticorps marqués, plasmide GF, etc.). Les signaux détectés par le système optique sont amplifiés, convertis en signaux électroniques puis en valeurs numériques. Elles sont analysées grâce à l’unité informatique du cytofluorimétre. Cette technique permet de faire individuellement et simultanément l’analyse quantitative et qualitative de plusieurs paramètres, selon des critères choisis, sur chaque élément mis en suspension dans un liquide. Ces éléments peuvent être des cellules, des bactéries, mais aussi des constituants subcellulaires.

Elle permet l’analyse de nombreux constituants cellulaires (acides nucléiques, lipides, protéines), d’organites isolés (noyaux, mitochondries, plastes, chromosomes) ou de certaines fonctions cellulaires (viabilité, activités enzymatiques…). Typiquement l’analyse se fait à plusieurs milliers d’objets par seconde.

Protocole de suivi de prolifération de PBMCs, par marquage avec une sonde fluorescente, le PKH26 Principe : Le PKH26 est une sonde fluorescente qui s’incorpore dans la membrane cellulaire de façon homogène. Lorsque les cellules se divisent, l’intensité de fluorescence du PKH26 va donc être diminué par 2. Une division supplémentaire induit une diminution d’un facteur 2 supplémentaire (etc.) par cytométrie en flux, on peut suivre la prolifération cellulaire en mesurant la diminution de l’intensité de fluorescence du PKH26 (120, 270) Marquage PKH26 – Ficoll : après ficoll, faire 3 lavages des PBMCs dans du PBS 1X (il faut éliminer toute trace de sérum) – Reprendre le PBMC dans un tube Falcon conique de 15 ml à 10 x 106 cellules / ml dans du diluent C (Volume V) préalablement mis à température ambiante (suspension cellulaire) – Préparer une solution de volume équivalent de diluent C contenant du PKH26 dilué au 1/400ème (Concentration finale de PKH26 : 2,5 µM