Lamiae
Sommaire: Utilisation et mise au point au niveau moléculaire de biomarqueurs pour étudier la répartition spatiale de la contamination au voisinage d’une source de pollution
LISTE DES ABREVATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
A.LES METAUX LOURDS
1. Mécanismes moléculaires de la toxicité des métaux lourds.
a. Effet sur la membrane cytoplasmique
b. Effet sur le noyau
c. Effet sur le système vacuolaire lysosomal
d. Effets sur les mitochondries
e. Effet sur le réticulum endoplasmique
2. Exemple de métaux lourds : Le cadmium
a. Propriétés physiques
b. Propriétés chimiques
c. Pénétration, accumulation et détoxification du cadmium
d. Cd chez les organismes marins
B. LES BIOINDICATEURS DE POLLUTION
1. Ruditapes decussatus
a. Position systématique
b. Coquille
c. Anatomie
d. Alimentation
e. Habitat et répartition géographique
f. Croissance
g. Reproduction
2. Cerastoderma glaucum et Cerastoderma edule
a. Taxonomie
b. Biologie de Cerastoderma glaucum/ edule
c. Différences morphologiques entre C. glaucum et C. edule
C. LES BIOMARQUEURS
1. Les métallothionéines
1.1 Classification et Nomenclature
1.2 Propriétés biochimiques
a. Composition en acides aminés
b. Fixation des ions métalliques
c. Structure primaire et spatiale
1.3 Rôle des métallothioneines
a. L’homéostasie du zinc et du cuivre
b. Détoxication des métaux
c. Protection contre le stress oxydant
1.4 Mécanisme d’induction des métallothionéines
1.5 Dégradation des métallothionéines
1.6 Mécanismes moléculaires de l’induction
a. Les promoteurs des gènes MTs
b. Contrôle transcriptionnel
1.7 Les métallothionéines comme biomarqueur
1.8 Les différentes méthodes de dosage des MTs
2. L’acétylcholinestérase
3. Malonedialdéhyde
a. Le stress oxydatif
b. Systèmes de défense contre le stress oxydatif
D. LES MARQUEURS GENETIQUES
CHAPITRE I: REPARTITION SPATIALE DE CADMIUM ET DE QUELQUES BIOMARQUEURS DETERMINES CHEZ CERASTODERMA GLAUCUM COLLECTEES D’UNE ZONE POLLUEE
A. INTRODUCTION
B. MATERIELS ET METHODES
1. Site de prélèvement : Zarb el Ain (ZA)
2. Echantillons
a. Choix
b. Collection
a. Figure I. 8: Grille finale de prélèvement.
3. Préparation des échantillons
a. Prétraitement
b. Dissection
4. Broyage
5. Minéralisation
6. Dosage du cadmium par spectrophotométrie d’absorption atomique
a. Principe
b. Appareillage
c. Condition opératoire
d. Etalonnage
e. Précision des analyses
7. Dosage des métallothionéines par la méthode colorimétrique
a. Principe de la méthode
b. Dosage des MTs
8. Dosage du malonedialdéhyde (MDA) au niveau de la glande digestive
a. Principe
b. Extraction du MDA
9. Dosage de l’acétylcholinestérase
10. Analyse statistique
C. RESULTATS
1. Choix des nœuds de la grille de prélèvement
2. Répartition spatial du Cd bioaccumulé et des biomarqueurs étudiés
3. Effets des facteurs biotiques (sexe, masse, taille) sur les concentrations des biomarqueurs étudiés
D. DISCUSSION
CHAPITRE II: VARIATIONS IN VIVO DES CONCENTRATIONS EN BIOMARQUEURS (METALLOTHIONEINE ET MALONEDIALDEHYDE) AVEC LE TEMPS ET LA CONCENTRATION DU CADMIUM CHEZ CERASTODERMA GLAUCUM
A. INTRODUCTION
B. MATERIELS ET METHODES
1. Site de prélèvement
2. Prélèvement et expérience de contamination in vivo
3. Préparation des échantillons
4. Dosage du cadmium, des métallothionéines et du malonedialdéhyde
5. Dosage des protéines
6. Test de « stress on stress »
7. Analyse statistique
C. RESULTATS
1. Variations de cadmium dans les tissus mous (in toto)
2. Variation des concentrations en métallothionéines au niveau des branchies et de la glande digestive de C. glaucum
a. Variation des MTs en fonction du facteur temps
b. Variation des concentrations en MTs en fonction du facteur concentration de CdCl
3. Variations des concentrations en protéines au niveau des branchies
4. Variation des concentrations en protéines au niveau de la glande digestive
5. Variation des concentrations en malonedialdéhyde au niveau de la glande digestive de C. glaucum
6. Le test de stress on stress
D. DISCUSSION
CHAPITRE III: CLONAGE ET CARACTERISATION D’ADNC DE METALLOTHIONEINE CHEZ DEUX BIVALVES MEDITERRANEENS: RUDITAPES DECUSSATUS ET CERASTODERMA GLAUCUM
A. INTRODUCTION
B. MATERIELS ET METHODES
1. L’expérience de contamination
2. Extraction des ARN totaux
3. Purification des ARN totaux
4. Transcription inverse (RT)
5. PCR (Polymerase Chain Reaction)
6. Extraction de fragments d’ADN de gels d’agarose
7. Clonage de fragments d’ADN
8. Transformation bactérienne
9. Extraction de l’ADN plasmidique
10. Séquençage automatique
11. Dot Blot
12. Analyse statistique
13. Outils d’analyses bioinformatiques
a. Les Banques de séquences nucléiques
b. Les programmes bioinformatiques de traitement des séquences nucleiques
C. RESULTATS
1. Isolement du 18S chez R. decussatus
2. Amplification de deux séquences partielles d’ADNc codant pour la MT
3. Expression de MT dans différents tissus
4. Expression du gène MT chez R. decussatus exposés au cadmium par rapport aux témoins
D. DISCUSSION
CHAPITRE IV: DIFFERENCIATION GENETIQUE ENTRE ESPECES ET POPULATIONS DU GENRE CERASTODERMA
A. INTRODUCTION
B. MATERIELS ET METHODES
1. Collection des échantillons
2. Dissection des échantillons
3. Extraction de l’ADN génomique
4. PCR
5. Electrophorèse
6. Extraction de l’ADN du gel d’agarose (Voir Chapitre III)
7. Séquençage automatique (voir chapitre III)
8. Traitement des données
9. Analyses statistiques
C. RESULTATS
1. Alignement des séquences 28S
2. Alignement des séquences ITS1
3. Alignement des séquences de COI
D. DISCUSSION
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
Extrait du mémoire utilisation et mise au point au niveau moléculaire de biomarqueurs
A. Les métaux lourds
Les métaux lourds sont présents dans l’eau de mer sous différentes formes chimiques. Ils peuvent être sous forme ionique ou adsorbés sur les particules minérales ou organiques. Leur disponibilité change très fortement avec les paramètres environnementaux tels que la température, la salinité et le pH. La spéciation d’un métal dans le milieu marin représente un problème fondamental car sa biodisponibilité et par conséquent sa toxicité dépend de sa forme chimique. Ainsi à une salinité de 35 /.., la majeure partie du chlorure de cadmium se transforme en un complexe neutre [CdCl (Viarengo, 1989).
1. Mécanismes moléculaires de la toxicité des métaux lourds
Chez les mollusques, il a été démontré qu’une contamination par les métaux lourds peut affecter la croissance, la consommation de l’oxygène, la reproduction etc (Viarengo, 1989). Néanmoins, peu de travaux ont été réalisés sur l’effet d’une contamination métallique au niveau cellulaire.
a. Effet sur la membrane cytoplasmique
La membrane cytoplasmique représente la première barrière pour les métaux au niveau de la cellule. Il a été démontré qu’en se liant aux protéines cytoplasmiques et aux phospholipides, les métaux engendrent une altération de leurs structures ainsi que de leurs fonctions (Evtushenko et al. 1986). L’un des effets le plus important des cations métalliques tel que le cadmium (Cd), le cuivre (Cu), le mercure (Hg) et l’argent (Ag) est l’inhibition de l’activité des ATP ases Na-K dépendantes (Bouquegneau et Gilles, 1979).
Les métaux lourds peuvent aussi altérer la structure de la membrane cellulaire en stimulant par exemple la peroxydation lipidique et en épuisant le contenu cellulaire en glutathion (GSH) nécessaire pour la protection contre le stress oxydatif (Dianzani et Ugazio, 1978).
b. Effet sur le noyau
Une fois dans la cellule, les métaux vont rapidement s’accumuler dans le noyau. (Bryan et Hidalgo, 1976). A ce niveau, ils vont stimuler la synthèse d’ARNm codant pour les métallothionéines (MTs), inhiber l’activité de l’ARN polymérase I et II responsables de la synthèse de l’ARNr et l’ARNm respectivement, altérer la structure et le métabolisme de l’ADN et causer des anomalies au niveau des chromosomes (Viarengo et al. 1982).
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