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Sommaire: Etude fonctionnelle de Pacmmar1, élément transposable de type mariner isolé chez le crabe Pachygrapsus marmoratus
Listes des figures, tableaux et annexes
Listes des abbréviations
Introduction bibliographique
I. Les éléments mobiles de classe II
1. Les transposons procaryotes (pour revue Merlin et Toussaint, 1999)
1.1 Les séquences d’insertions (IS)
1.2 Les séquences composites
1.3 Les séquences non composites
2. Les transposons eucaryotes
2.1 Sous-classe 1
2.2. Sous-classe 2
2.3. Les MITES (Miniature Inverted Repeat Transposable Element)
II. La superfamille Tc1-mariner
1. La famille TLE (Tc1-like element)
2. La famille MLE (mariner like element)
3. Caractéristiques structurales des transposons Tc1-mariner
3.1. Caractéristiques nucléiques
3.2. Caractéristiques protéiques
III. Mécanisme de transposition de type « couper-coller »
1. Les transposons Tc1-mariner actifs
2. Le mécanisme de transposition
2.1. Fixation à l’ADN
2.2. Formation du complexe synaptique
2.3. Excision du transposon
2.4. Intégration dans le site cible
3. Mécanisme de régulation de la transposition
3.1. Régulation de la transcription
3.2. Inhibition par surproduction de la transposase
3.3. Complémentation de type dominant-négatif
3.4. ITRs leurres
4. Facteurs influençant l’efficacité de transposition
4.1. Cations bivalents
4.2. Température
4.3. Taille du transposon
5. Influence des facteurs d’hôtes
IV. Intérêt de l’étude des MLEs et TLEs
1. Intérêt fondamental
1.1. Mode de propagation et évolution des éléments transposables
1.2. Impact des éléments transposables sur l’évolution des génomes
2. Intérêt des éléments transposables en biotechnologie
V. L’ élément mariner Pacmmar1
Résultats et discussion
I. Caractérisation de l’élément Pacmmar1
1. Résultats
1.1. Nombre de copies de l’élément Pacmmar1 dans le génome-hôte
1.2. Caractérisation des ITRs de l’élément Pacmmar1
1.3. Recherche d’éléments Pacmmar1 complets dans le génome-hôte
1.4. Analyse in silico des éléments Pacmmar1.1 et Pacmmar1.2
2. Discussion
II. Etude fonctionnelle de l’élément Pacmmar1
A. Etude fonctionnelle de l’élément Pacmmar1 in vitro
1. Résultats
1.1. Production de la transposase
1.2. Tests de transposition in vitro
1.3. Etude de la fixation des transposases à l’ADN
1.4. Etude de l’activité de clivage des transposases
1.4.3.3. Spécificité de clivage du transposon
1.4.3.4. Détermination du site de clivage
1.5. Activité d’insertion des transposases
2. Discussion
B. Activité des transposases en cellules eucaryotes
1. Résultats
1.1. Production des transposases
1.2. Tests de transposition in vivo
1.3. Détermination des sites d’excision
1.4. Etude de l’insertion du pseudo transposon
1.4.2. Détermination du nombre d’insertions par génome
1.5 Localisation cellulaire des transposases
2. Discussion
C. Etude de l’activité de la transposase sur support polymère conducteur
1. Principe de fonctionnement des supports biocapteurs
2. Etude de l’activité de la transposase sur support polymère
2.1. Principe
2.2. Résultats
2.3. Conclusion
Conclusion et perspectives
Matériels et méthodes
I. Matériels
1. Pachygrapsus marmoratus
2. Souches bactériennes et milieux de culture
3. Lignées cellulaires et traitement des cellules
4. Amorces et oligonucléotides
II. Méthodes
1. Techniques de base de biologie moléculaire
1.1 Extraction d’ADN génomique
1.2 Extraction de plasmide
1.3 Purification d’ADN par phénol/chloroforme
1.4 Amplification d’ADN par PCR (réaction de polymérisation en chaîne)
1.5 Clonage des fragments amplifiés par PCR
1.6 Production de bactéries chimiocompétentes
1.7 Transformation bactérienne
1.8 Séquençage
2- Caractérisation de l’élément Pacmmar1
2.1 Caractérisation des ITRs de Pacmmar1
2.2 Recherche de nouvelles copies de l’élément
2.3 Dot blot
3- Activité des transposases in vitro
3.1 Constructions des plasmides
3.2 Production des transposases
3.3 Test de transposition in vitro
3.4 Etude de l’activité de fixation par retard de migration sur gel
3.5 Etude de l’activité de coupure
3.6 Détermination des sites de coupure
3.7 Test d’insertion
4. Etude de la fonctionnalité in vivo
4.1 Constructions des plasmides
4.2 Test de transposition
4.3 Test d’excision
4.4 Localisation des sites d’insertion
4.5 Southern blot
4.6 Western blot
4.7 Localisation cellulaire par immunofluoresence
5- Méthodes Bio-informatiques
6- Etude de l’activité de la transposase sur support polymère conducteur
6.1 Ancrage de Pacmmar1 sur une matrice polymère
6.2 Etude de l’activité de la transposase
Références bibliographiques
Annexes
Extrait du mémoire Etude fonctionnelle de Pacmmar1, élément transposable de type mariner isolé chez le crabe Pachygrapsus marmoratus
Introduction bibliographique
Les éléments mobiles ou éléments transposables (ETs) sont des séquences d’ADN moyennement à hautement répétées dans les génomes et ayant la capacité de se déplacer (transposer) au sein de ces génomes. Ils ont été découverts dans les années 40 par Barbara McClintock qui travaillait sur les accidents chromosomiques et l’instabilité de mutations du maïs (McClintock, 1948). Depuis, des ETs ont été mis en évidence dans tous les génomes où ils ont été recherchés, procaryotes et eucaryotes, animaux et végétaux, à l’exception du parasite plasmodium falciparum et certainement de quelques espèces proches (Sarka et al., 2003).
Les ETs occupent une part importante des génomes de plantes (jusqu’à 80%), de champignons (3 à 20 %), des bactéries et de métazoaires (3 à 45 %) (Feschotte, 2002 ; Chandler et Mahillon, 2002 ; Morgante, 2005; Daboussi et Capy, 2003 ; Hua Van et al., 2005).
Les ETs ont longtemps été considérés comme des « parasites génétiques » ou de l’« ADN égoïste » ayant pour seul objectif d’assurer leur survie au sein des génomes.
Maintenant il est reconnu que les ETs jouent un rôle fondamental dans l’évolution et la plasticité des génomes. Ils permettent l’augmentation de la taille des génomes, et induisent différents types de réarrangements génétiques (Miller et Capy, 2004). Chez les procaryotes, ils sont à l’origine de l’acquisition de nouvelles fonctions comme la résistance aux antibiotiques ou le catabolisme de nouveau métabolites (Saedler et Gierl, 1996). De plus, ils contribuent à l’apparition de nouveaux gènes par domestication des ETs par le génome hôte qui va utiliser les fonctions de l’ET pour son propre fonctionnement. Ce phénomène de domestication a permis, par exemple, la mise en place de la recombinaison V(D)J dans le système immunitaire des mammifères (Kapitonov et Jurka, 2005). La télomérase pourrait également avoir pour origine un rétrotransposon (Nakamura et Cech, 1998).
Pour assurer leur propagation, les ETs utilisent différents mécanismes de transposition, qui sont à l’origine de leur classification. Plusieurs classifications ont été proposées pour les ETs (Finnegan, 1989 ; Wicker et al., 2007, Kapitonov et Jurka., 2008). Ces classifications reprennent la division des ETs en deux grandes classes : les éléments de classe I qui se déplacent via un intermédiaire ARN et les éléments de classe II qui se déplacent via un intermédiaire ADN (figure 1). Pour les éléments de classe I, appelés rétro-éléments, l’élément est copié sous forme d’ARN simple brin par l’ARN polymérase de l’hôte, puis rétro-transcrit par une reverse transcriptase et intégré dans un nouveau site par une intégrase. On parle de mécanisme de transposition de type « copier-coller ». Pour les éléments de classe II, l’élément est directement excisé de son site pour être intégré dans un nouveau site. On parle dans ce cas de mécanisme de type « couper-coller ». Le déplacement est généralement catalysé par une enzyme unique, la transposase. Il est à noter que l’on peut également classer les ETs suivant les acides aminés impliqués dans la catalyse de la transposition. On distingue ainsi 5 familles de protéines : les transposases de types DDE, les tyrosine transposases, les sérines transposases, les Y2 transposases et les protéines ayant une activité réverse transcriptase et endonucléase (Curcio, MJ., and Derbyshire, KM., 2003).
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