Mécanismes de régulation du facteur d’échange EFA6

Mécanismes de régulation du facteur d’échange EFA6

Culture cellulaire et transfection

 Les cellules BHK-21 (Baby Hamster Kidney) sont cultivées dans du milieu de culture BHK-21 (Gibco-BRL), contenant 5% de sérum de veau foetal, 10% de tryptose phosphate broth, 100 unités/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Ces cellules sont ensuite transfectées transitoirement avec les plasmides codant pour les protéines d’intérêt à l’aide des agents de transfection Jet Pei (Polyplus transfection, Illkirch, France) ou Fugene 6 (Roche) comme décrit par les fournisseurs. 

Réactifs et anticorps 

Le GTPγS[ 35S] provient de Perkin Elmer et les Azolectines de Sigma Chemical (St Louis, MO). Les anticorps suivant ont été utilisés: l’anticorps monoclonal de souris dirigé contre l’épitope VSV-G (clone P5D4; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), l’anticorps monoclonal de souris dirigé contre l’épitope HA (clone 12CA5; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), l’antisérum de lapin contre la GFP (Clontech), l’anticorps monoclonal de souris anti-His (Sigma), l’anticorps monoclonal de souris anti-Arf6 (clone 8A6-2 fourni par S. Bourgoin, Sainte-Foy, Canada). L’anticorps de chèvre anti-βarrestine1 (K16 and C19) et antiβarrestine2 (C18) proviennent de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Heidelberg). L’anticorps secondaire couplé à la Texas-Red vient de Jackson ImmunoResearch (Interchim, France).

Construction ADN

 Les plasmides codant pour le récepteur 2-adrénergique étiqueté GFP et la βarrestin1 nous ont été fournis par C. Moore et J. Benovic (Université Thomas Jefferson, Philadelphie). Les plasmides codant pour les constructions His–PH-C-ter, les différentes constructions d’EFA6 étiquetées vsv-G, GFP–PH-C-ter, GFP-C-ter, His–Arf6 et His-Arf1 ont été précédemment décrits. Les séquences codant les résidus d’EFA6A humain 1–645 (protéine entière); 125–347 (Sec7); 351–645 (PH-Cter); 490–645 (Cter); 490–525 (ProN); 525-600 (CC); 600-645 (ProC); 124 490-600 (ProN-CC) et 525-645 (CC-ProC) ont été obtenus par PCR et clonés dans un vecteur pGEX-3X (GE Healthcare) pour fusion avec la GST au niveau de l’extréminté N-terminale. 

Production et purification de protéines GST et HisTag 

Les différentes constructions couplées à la GST ou possédant une étiquette His sont produites dans des bactéries BL21. Le culot bactérien est récupéré puis resuspendu dans du tampon de lyse froid (Tris pH8 50mM ; NaCl 150mM ; MgCl2 2mM; glycérol 10% [phenylmethylsulphonyl fluoride] PMSF 0.25mM et un mélange d’inhibiteurs de protéases pour les GST et Tris pH8 50mM ; NaCl 100mM ; MgCl2 1mM; mercapto ethanol 5mM; glycérol 10%, imidazole 50mM, [phenylmethylsulphonyl fluoride] PMSF 0.25mM et un mélange d’inhibiteurs de protéases pour les His. La suspension bactérienne est soumise à 2 passages à la Presse de French maintenue à 4°C afin de lyser les bactéries, puis centrifugée. Le surnageant est récupéré et ultracentrifugé à 35.000 rpm pendant 2h à 4°C. Après récupération, le surnageant est incubé avec des billes de Glutathion Sepharose (GST) ou des billes Ni-NTA (His) sur la nuit. Le lendemain les billes sont lavées 3 fois avec du tampon de lyse puis les protéines sont éluées avec du tampon d’élution (tampon de lyse complémenté avec de la Glutathion Sepharose 20mM et NaCl 100mM pour les GST et tampon de lyse avec 200mM imidazole pour les His). 6 fractions de 1ml sont collectées puis analysées sur gel de poly-acrylamide et les protéines sont révélées par coloration au bleu de Coomassie. Les fractions contenant la protéine sont dialysées afin d’éliminer le Glutathion Sepharose puis centrifugées sur Centricon pour concentrer les protéines. 

Pull down sur lysat cellulaire 

Après 24h de transfection, les cellules BHK, ensemencées à 2.105 cellules dans des boites de Pétri de diamètre 10cm, sont lavées en PBS à froid, lysées par un tampon de pull-down (Tris/HCl pH=8,0 50mM, MgCl2 10mM, NaCl 100mM, Triton X100 1%, glycérol 10%, DTT 2mM et un mélange d’inhibiteurs de protéases) puis centrifugées 10min à 13200rpm à 4°C. Le lysat cellulaire ainsi obtenu est incubé avec 1μM à 3μM de protéines purifiées étiquetées GST, 0,75% de BSA et des billes de Glutathion Sepharose. Le mélange est ainsi mis sous agitation à 4°C pendant 15h. Les billes sont ensuite lavées deux fois en tampon de lyse puis une fois en PBS et les protéines éluées dans 30μl de tampon dénaturant. Les échantillons 125 sont mis à bouillir pendant 5min puis déposés sur gel de polyacrylamide et l’interaction des protéines est analysée par western-blot avec les anticorps correspondants.

Fractionnement cytosol/membrane

 Après 24h de transfection, les cellules BHK, ensemencées à 2.105 cellules dans des boites de Pétri de diamètre 10cm sont lavées en PBS. Elles sont ensuite récoltées dans 2ml de PBS puis mises à centrifuger 5 minutes à 1500 rpm à 4°C. Puis le culot cellulaire est homogénéisé 5 minutes à 4°C dans un tampon contenant 250 mM de sucrose, 3 mM d’imidazole, pH 7.4, et un mélange d’inhibiteurs de protéases et centrifugé pendant 10 minutes à 3000 rpm à 4°C. Le culot est resuspendu dans 100µl de tampon d’homogénéisation à l’aide d’une aiguille 0,6 afin de lyser les cellules puis le lysat est mis à centrifuger pendant 5 minutes à 4500rpm à 4°C. Le surnageant dépourvu de noyau PNS (post-nuclear supernatant) est collecté puis ultra-centrifugé dans un rotor Beckman TLA 100.1 pendant 45 minutes à 70000 rpm à 4°C pour séparer les fractions cytosoliques et membranaires. Le surnageant correspondant à la fraction cytosolique est collecté et le culot correspondant à la fraction membranaire est resuspendu dans un volume équivalent. Les échantillons sont ensuite bouillis pendant 5 minutes puis déposés sur gel de polyacrylamide et enfin analysés par coloration au bleu de Coomassie ou par western-blot. 

Sédimentation

3µM de vésicules d’azolectine sont incubées avec 2 à 3 µM de protéines Arf6 gly GDP ou GTP et His-PH-C-ter seul ou ensemble dans un tampon HKM pH 7.5 (Hepes 50mM, KCl 100mM et MgCl2 2mM). Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, les 70µl de mélange sont mis à centrifuger dans un rotor Beckman TLA 100.1 pendant 13 minutes à 70000 rpm à 25°C. Le surnageant et le culot qui a été resuspendu dans 70µl de tampon HKM sont mis à bouillir pendant 5min puis déposés sur gel de polyacrylamide puis analysés par coloration au bleu de Coomassie ou par western-blot.

Pull down protéines purifiées 

De 0,5μM à 3μM de protéines purifiées possédant une étiquette poly-Histidine sont incubées dans un tampon de lyse (Tris/HCl pH=8,0 50mM, MgCl2 10mM, NaCl 100mM, Triton X100 1%, glycérol 10%, DTT 2mM et un mélange d’inhibiteurs de protéases) avec 3μM 126 de protéines purifiées couplées à une GST, 0,75% de BSA ainsi que des billes de Glutathion Sepharose pendant 2h30 à 4°C sous agitation. Enfin les billes sont lavées deux fois en tampon de pull-down puis une fois en PBS et les protéines éluées dans 30μl de tampon dénaturant. Les échantillons sont mis à bouillir pendant 5 minutes puis déposés sur gel de polyacrylamide et l’interaction des protéines est analysée par western-blot avec les anticorps correspondants. 

Cinétiques d’échange nucléotidique radioactif sur les Arf

1,4µM de protéines Arf6 ou Arf1 sont pré-incubées dans un tampon HKM (Hepes 50mM pH 7,5, KCl 100mM et MgCl2 1mM) en présence d’azolectine avec 2mM EDTA et 0,5 à 10µM des différentes protéines d’intérêt (GST-C-ter ; GST PH-C-ter et arrestine) pendant 15 min à température ambiante. La cinétique d’échange spontanée est déclenchée par l’ajout de 100µM de nucléotides radioactifs GTPγS[35S] et le mélange est placé à 37°C. Pour chaque temps une aliquote du mélange est prélevé et filtré sur membrane de nitrocellulose afin de déterminer la quantité de protéines Arf liées au GTPγS[35S] exprimée en cpm (coups par minute). Pour l’échange catalysé, la protéine Arf6 (1,4µM) est pré-incubée dans un tampon HKM en présence d’azolectine avec 50nM d’His-EFA6 et/ou 10µM de GST-C-ter pendant 15 minutes à température ambiante. La cinétique est déclenchée par l’ajout de 100µM de nucléotides radioactifs GTPγS[35S] et le mélange est placé à 37°C. Pour chaque temps un aliquote du mélange est prélevé et filtré sur membrane de nitrocellulose afin de déterminer la quantité de protéines Arf kiées au GTPγS[35S] exprimée en cpm (coups par minute).