Mécanismes d’action des peptides antimicrobiens cationiques

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Structure et classification des peptides antimicrobiens

Les PAMs constituent la première ligne défense de nombreux organismes vivants qui regroupent les organismes invertébrés et vertébrés. Ils peuvent être produits au cours de la réponse immunitaire ou être stockés dans des granules sous forme de précurseurs, puis être excrétés sous forme active par clivage de ces précurseurs suite à une agression extérieure. Certains PAMs peuvent être sécrétés localement, comme les magaïnines par exemple qui sont sécrétée par la peau d’amphibiens.
On distingue deux voies de synthèse des PAMs : la voie non-ribosomale et la voie ribosomale. Les PAMs obtenus par la voie non-ribosomale sont essentiellement des peptides synthétisés par les organismes inférieurs que sont les bactéries, les champignons et les streptomycètes. Ils sont produits à partir de complexes multi-enzymatiques et sont à l’origine de plusieurs classes d’antibiotiques (Finking and Marahiel, 2004).
La voie de synthèse ribosomale des PAMs concerne les PAMs produits par une grande diversité d’organismes vivants comprenant les mammifères, les reptiles, les oiseaux, les amphibiens, les insectes, les plantes et les microorganismes (Hancock and Chapple, 1999). Ces PAMs, dits « naturels », sont stockés dans des granules de sécrétion et sont libérés sur le site d’agression lors de la réponse immunitaire (Devine, 2003; Levy, 2004).
Malgré leur diversité structurale, les PAMs conservent des caractéristiques communes qui semblent essentielles à leur activité antimicrobienne (Hancock, 1999; Hancock and Lehrer, 1998; Jenssen et al., 2006). Il s’agit de molécules de petite taille, constituées de moins de 50 acides aminés en général, amphipatiques et dont la grande majorité acquière une charge globale positive de par la présence de nombreux résidus Arginine et/ou Lysine, leur conférant un caractère cationique. La séquence d’acides aminés constituant un PAM, allant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale, constitue sa séquence primaire qui est linéaire. Les acides aminés présents dans la chaîne peptidique peuvent interagir entre eux, lui conférant une certaine structure secondaire. Cette structure plus complexe peut être de deux types : les hélices α et les feuillets β. La séquence tertiaire des PAMs consiste au repliement de la chaîne polypeptidique dans l’espace. Elle inclut la présence de ponts disulfures. Les structures secondaires et tertiaires d’un peptide conditionnent son mode de fonctionnement.
Plusieurs classifications ont été établies et il n’existe actuellement aucune nomenclature universelle. Ils peuvent être classés selon leur charge globale en deux familles : les PAMs cationiques et les PAMs anioniques. Cependant, notre PAM d’étude, nommé P17 et isolé à partir du venin de la fourmi Tetramorium bicarinatum, est un peptide linéaire cationique. De ce fait, nous nous focaliserons sur ces derniers, dans ce manuscrit. Leur structure permet de classer les PAMs cationiques en 3 familles principales :
– Les peptides linéaires formant des hélices α
– Les peptides riches en Cystéines, contenant un ou plusieurs ponts disulfures
– Les peptides riches en certains acides aminés

Les peptides linéaires formant des hélices α

Cette structure est la plus étudiée et est adoptée par de nombreux PAMs de vertébrés et d’invertébrésdans un solvant apolaire mimant ainsi l’environnement membranaire lipidique. Dans cette structure, on retrouve la majorité des acides aminés polaires ou chargés sur une face de l’hélice et les acides aminés hydrophobes sont localisés sur la face opposée. Ceci confère aux PAMs un caractère amphiphile qui semble être à l’origine de leur propriété commune d’interagir avec la bicouche lipidique de la paroi des pathogène, d’en perturber l’organisation et d’induire ainsi la lyse cellulaire. De ce fait, ces PAMs sont souvent dotés d’une activité cytotoxique mais ont aussi des propriétés antimicrobiennes et parfois même insecticides(Nguyen et al., 2011). Ces peptides ont une forte hydrophobicité, avec leur face apolaire qui recouvre une plus grande surface que la face polaire, riche en Lysine et fortement chargée. Ces peptides linéaires sont aussi caractérisés par l’absence de Cystéines dans leur séquence.Les peptides linéaires en hélice α sont très représentés chez les insectes. A titre d’exemple, les cécropines (Bechinger, 1997), PAMs retrouvés chez les insectes et les mammifères, ainsi que le LL-37(Porcelli et al., 2008), qui représente le seul PAM de la famille des cathélicidines humaines identifié, adoptent cette structure en hélice α (Figure 1). Ce peptide est majoritairement produit par les cellules épithéliales et neutrophiles humains à partir du précurseur hCAP18 (Cationic peptide 18) de 18 kDa de masse. Ce dernier est stocké sous forme inactive dans des granules des neutrophiles, puis libéré et clivé lorsque la réponse inflammatoire est déclenchée pour fournir le LL-37 actif (4,5 kDa).

Les peptides à ponts disulfure

Certains peptides sont riches en Cystéines et sont, de ce fait, caractérisés par la présence d’un ou plusieurs ponts disulfures intramoléculaires qui imposent une structure tertiaire et la stabilisent (Andrès and Dimarcq, 2007; Brogden, 2005). Ces peptides adoptent une structure en épingle à cheveux β. Certains PAMs ne contiennent qu’un seul pont disulfure et sont très nombreux chez les amphibiens. C’est le cas des tigérines, produites par la grenouille indienne R. tigerina (Bulet et al., 2004). On retrouve notamment dans ce groupe les défensines(Chen et al., 2006), PAMs conservés aussi bien chez les vertébrés que les invertébrés, qui contiennent 3 ou 4 ponts disulfures (Figure 1).

Les peptides linéaires riches en certains acides aminés

A l’inverse des autres PAMs, ces peptides n’adoptent pas de structures secondaire en hélice α ou en feuillets β et possèdent une séquence dans laquelle un acide aminé prédomine (Andrès and Dimarcq, 2007; Diamond et al., 2009). Plusieurs PAMs ont été identifiés à ce jour. Chez les insectes, on retrouve notamment des peptides riches en proline qui représente au moins 25% des acides aminés présents, ou encore en glycine, comme les attracines et les diptéricines produites par la drosophile Drosophila melanogaster(Andrès and Dimarcq, 2007).Certains PAMs de mammifères sont également riches en certains acides aminés comme l’histatine, isolée de la salive de primates dont l’homme et riche en histidine(De Smet and Contreras, 2005; Lehrer and Ganz, 1999), ou encore le dérivé de cathélicidines PR-39 retrouvé chez le porc, riche en proline (49%) et en arginine (24%) (Brogden, 2005; Gudmundsson et al., 1995).

Les peptides antimicrobiens produits par les insectes

Généralités sur les peptides antimicrobiens d’insectes

Les insectes sont des sources importantes des PAMs.Le premier PAM d’insecte découvert fut la melittine, isolée à partir du venin d’abeille (Habermann, 1972). Elle fut suivie par la mise en évidence de la cécropine, en 1980(Hultmark et al., 1980). Il s’agit de peptides cationiques, amidés en C-terminal, qui adoptent une conformation en hélice α dans un environnement hydrophobe.La majorité des PAMs issus des insectes sont synthétisés sous forme de précurseurs puis produits sous forme active par protéolyse contrôlée lorsque leur mobilisation est nécessaire.Ils sont synthétisés par le corps gras des insectes, possédant les propriétés fonctionnelles du foie et du tissu adipeux des mammifères, et sécrétés dans l’hémolymphe correspondant au sang(Andrès and Dimarcq, 2004; Zasloff, 2002).
Les insectes venimeux libèrent leurs PAMs dans leur venin qui est riche en composés assurant leur défense et servant à la prédation. Ils se classent en trois classes: les hémiptères (pucerons, punaises, etc…), les lépidoptères, qui correspondent aux papillons (forme adulte) et aux chenilles sous forme larvaire, et les hyménoptères qui représentent le groupe d’insecte le plus vaste (120 000 espèces décrites) (van Emden, 2013) et regroupent notamment les guêpes, les abeilles et les fourmis. Ces dernières, dont la masse totale dépasse celle de l’ensemble de l’humanité observent des règles de vie en société assimilables à la société humaine, et ont développé des systèmes de défense immune élaborés qui leur permettent de défendre les colonies contre l’infection par divers pathogènes. Ces caractéristiques en font un modèle d’étude intéressant pour la recherche au niveau comportemental et immunitaire.

Les peptides antimicrobiens issus du venin de fourmis

Les fourmis sont des insectes sociaux venimeux et ubiquistes, qui représentent 15 à 20% de la biomasse animale en forêt tropicale. Le nombre d’espèces de fourmis est estimé à 25 000 et actuellement, ce sont plus de 14 700 espèces qui ont été décrites. Toutes les espèces de fourmis sont venimeuses et les femelles possèdent un appareil venimeux constitué de deux glandes tubulaires qui sécrètent les différents composés du venin, notamment les PAMs. Ces deux glandes allongées sont associées dans leur partie basale à la poche à venin qui sert de réservoir, elle-même reliée à l’aiguillon situé à l’extrémité de leur abdomen, via un canal excréteur. Cependant, la présence d’aiguillon n’est pas observée chez toutes les espèces de fourmis et cette propriété influence le mode de libération du venin. Les fourmis possédant un aiguillon développé et fonctionnel, dont le nombre est estimé à 9 100 espèces, injectent leur venin. En revanche, les fourmis dépourvues d’aiguillon fonctionnel libèrent leur venin en le pulvérisant ou en le déposant sur les cuticules de leurs proies. L’injection des toxines peptidiques est nécessaire à leur activité et de ce fait, le venin des fourmis dépourvues d’aiguillon est censé contenir peu de toxines peptidiques.
Le venin des fourmis présente une très grande diversité de fonction et de composition qui diffèrent selon les espèces. Sa composition dépend du mode d’administration du venin mais aussi du régime alimentaire des fourmis. On distingue les fourmis omnivores des fourmis prédatrices généralistes (se nourrissent d’une grande diversité d’invertébrés et petits vertébrés) ou spécialisées (se nourrissant d’un panel restreint d’invertébrés) dont la composition du venin sera propre à ces différentes espèces.
Chez la fourmi comme dans la plupart des animaux venimeux, celui-ci est composé, pour 90% de son poids sec, de protéines et peptides qui apportent la majorité des propriétés toxiques du venin. On y retrouve notamment des enzymes (phospholipases, phosphatases, estérases, etc…) qui servent à lyser les parois cellulaires et agissent comme facteurs de diffusion tissulaire des autres composés toxiques, et de nombreux peptides bioactifs, dont les PAMs. Les enzymes peuvent également être de puissants allergènes, cette fonction étant retrouvée chez les hyménoptères (Schmidt et al., 1986).Ces différences de composition du venin engendrent une importante diversité fonctionnelle. En effet, les fourmis utilisent leur venin dans la prédation pour capturer leurs proies, mais aussi pour se protéger contre leurs propres prédateurs et dans la défense immune contre divers microorganismes. Ces différentes propriétés divergent entre espèces d’un même genre. Le venin de fourmis est une source riche de peptides antimicrobiens et plusieurs de ces peptides ont été isolés et identifiés dans le venin de différentes espèces comme Tetramorium bicarinatum (bicarinaline), Paraponera clavata (ponéricine-Q42), Camponotus floridanus (défensines). La majorité de ces PAMs adoptent une structure linéaire en hélice α (Cologna et al., 2013; Johnson et al., 2013; Orivel et al., 2001; Rifflet et al., 2012).
Notre équipe s’intéresse principalement au genre Tetramorium, et étudie plus particulièrement le venin de l’espèce Tetramorium bicarinatum.

Les peptides antimicrobiens produits par la fourmi Tetramorium bicarinatum

Le genre Tetramorium comprend 445 espèces connues à ce jour. Parmi les différentes espèces de ce groupe, la fourmi terricole Tetramorium bicarinatum, originaire de l’Asie du Sud-Est, est l’espèce la plus répandue et la plus abondante dans le monde. Tetramorium bicarinatum est une Myrmicinae qui appartient à la famille des Formicinae. Elle fut identifiée pour la première fois par Nylander en 1846, sous l’appellation de Myrmica bicarinata.Cette fourmi « vagabonde » est très répandue dans les régions tropicales et subtropicales. Elle s’est également acclimatée aux régions à climat tempéré, dans les endroits chauds et secs et est actuellement présente dans tous les continents. Leur croissance se compose, comme pour toutes les fourmis, de quatre étapes différentes (œufs, larves, nymphes et stade adulte) et dure en moyenne 43,44 ±1,90 jours (Astruc et al., 2001). Après la ponte, le stade œufs dure de deux à six semaine avant d’éclore pour donner naissance à des larves blanches. Ce stade larvaire est composé de trois étapes de développement différentes et dure plusieurs semaines. Par la suite, les larves évoluent en nymphes qui aboutiront au stade de développement adulte.
L’appareil à venin de ces fourmis comporte deux glandes à venin qui débouchent sur le réservoir à venin, et de la glande de Dufour qui est de plus petite taille, située à la base de l’appareil vulnérant et qui joue un rôle dans l’attraction des congénères en libérant des phéromones de piste sur le sol (Figure 2).
Les fourmis Tetramorium bicarinatum composant notre élevage sont originaires de l’état de Bahia, situé dans la région Nord-Est du Brésil. Notre équipe s’intéresse aux défenses immunitaires de ces fourmis ainsi que leur venin. Nous nous focalisons plus particulièrement sur certains peptides antimicrobiens issus de ce venin. En effet, notre équipe a récemment observé que le venin de cette fourmi démontrait une activité biologique positive envers les bactéries des souches S. aureus et S. xylosus (Rifflet et al., 2012). Après avoir fractionné le venin par chromatographie et isolé la fraction biologiquement active, notre équipe a identifié, par migration électrophorétique sur gel SDS-PAGE (Sodium-dodécylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) et spectrométrie de masse, deux peptides majoritairement présents dans cette fraction. Ces deux peptides nommées bicarinaline (ou P16) et P17 et dont la séquence a été déterminée par séquençage de novo (MS2) et dégradation d’Edman, sont des peptides cationiques amphipatiques de 20 et 13 acides aminés respectivement, amidés en à leur extrémité C-terminale (Rifflet et al., 2012). Après synthèse biochimique de ces deux peptides, leur activité biologique a été évaluée.
La bicarinaline (ou P16) a été caractérisée pour avoir une activité microbicide dirigée contre un large panel de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, assimilable à l’activité de la mellitine, sans avoir d’activité hémolytique sur les érythrocytes humains (Rifflet et al., 2012). Cependant, elle démontre une forte activité cytotoxique sur les monocytes humains (Téné et al., 2016) même à faibles doses, ce qui en limite son étude sur ces cellules. A l’inverse, le P17 est un peptide dont l’activité microbicide est plus faible. En effet, aucune activité antibactérienne n’a été observée sur les bactéries testées en laboratoire (Rifflet et al., 2012). Il exerce par contre un effet microbicide sur la levure C. albicans et ne présente pas ou peu de cytotoxicité vis-à-vis des monocytes humains, même à de fortes concentrations (données obtenues au laboratoire).
Les PAMs représentent donc une grande diversité de molécules bioactives servant à la défense immune. Cette diversité est caractérisée par la variété d’espèces productrices, la structure des PAMs mais aussi leurs caractéristiques physico-chimiques, notamment leur charge globale. Le tableau 1 ci-dessous résume les principaux PAMs étudiés.

Table des matières

Introduction Bibliographique
Les peptides antimicrobiens
I. Structure et classification des peptides antimicrobiens
1. Les peptides linéaires formant des hélices α
2. Les peptides à ponts disulfure
3. Les peptides linéaires riches en certains acides aminés
II. Les peptides antimicrobiens produits par les insectes
1. Généralités sur les peptides antimicrobiens d’insectes
2. Les peptides antimicrobiens issus du venin de fourmis
3. Les peptides antimicrobiens produits par la fourmi Tetramorium bicarinatum
III. Mécanismes d’action des peptides antimicrobiens cationiques
1. Modèle de déstabilisation en tapis ou Carpet-like model
2. Modèle des pores toroïdaux ou Wormhole model
3. Modèle de pores en douve de tonneaux ou Barrel-stave model
4. Cibles intracellulaires des peptides antimicrobiens
a) Inhibition de la synthèse du peptidoglycane
b) Inhibition de la synthèse protéique bactérienne
IV. Mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens
Les macrophages
I. Origine et différenciation
II. Propriétés fonctionnelles des macrophages
1. La phagocytose
2. Les intermédiaires réactifs de l’oxygène (IROs)
3. Cytokines/chimiokines
a) Les cytokines
b) L’inflammasome
c) Les chimiokines
4. Eicosanoïdes
a) La voie des cyclooxygénases
b) La voie des lipoxygénases
III. Polarisation des macrophages
1. Les macrophages M1
a) Caractéristiques phénotypiques
b) Récepteurs exprimés à la surface des macrophages M1
i. Les récepteurs Toll-like (TLRs)
ii. Les récepteurs reconnaissant les pathogènes opsonisés
c) Facteurs de transcription impliqués dans la polarisation M1 des macrophages
i. STAT-1
ii. IRF5
iii. NF-κB
2. Les macrophages M2
a) Caractéristiques phénotypiques
b) Les différents sous-types de macrophages M2
i. Macrophages M2a
ii. Macrophages M2b
iii. Macrophages M2c
iv. Macrophages M2d
c) Récepteurs exprimés à la surface des macrophages M2
i. Les récepteurs scavenger
ii. Les récepteurs lectine de type C (CLRs)
d) Facteurs de transcription impliqués dans la polarisation M2 des macrophages
i. STAT-6
ii. PPARγ
iii. LRH-1
e) Rôle des macrophages M2 dans la réponse à Candida albicans
i. Reconnaissance et élimination de C. albicans par les macrophages
ii. Polarisation des macrophages en réponse à C. albicans
Rôle des peptides antimicrobiens dans l’immuno-modulation
I. Modulation de la défense immune innée par les PAMs
1. Effets des PAMs sur la production de cytokines/chimiokines par les cellules immunitaires innées
2. Effet des PAMs sur le chimiotactisme
3. Effet des PAMs sur la modulation de la réponse inflammatoire et la réponse antiinfectieuse
a) Contrôle de la réponse inflammatoire
b) Contrôle de la réponse anti-infectieuse
II. Modulation de la défense immune adaptative par les PAMs
III. Mécanismes d’action
IV. Implication des PAMs dans les pathologies
Résultats
Conclusion générale Et perspectives
Références