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Résistance de P. falciparum aux antipaludiques
Définition
La résistance est définie comme la capacité d’une souche parasitaire à survivre ou à se développer en dépit de l’administration et de l’absorption d’un médicament donné à des doses égales ou supérieures à celles habituellement recommandées mais dans les limites de la tolérance du médicament. La forme active du médicament doit pouvoir atteindre le parasite ou accéder à l’intérieur du globule rouge infecté pendant la durée nécessaire à son action normale (Pradines et al., 2010).
L’émergence et la propagation de la résistance aux antipaludiques posent un sérieux problème de santé publique. En effet, les échecs prophylactiques ou thérapeutiques entrainent une réémergence de la maladie. Les conséquences sanitaires sont : une augmentation de cas d’hospitalisation, de mortalité infantile et la transmission de la maladie.
Les facteurs favorisant la survenue de la chimiorésistance
La résistance permanente de P. falciparum aux médicaments antipaludiques s’explique d’abord par sa grande diversité génétique due à un taux élevé de mutations dans son génome et par les masses très importantes de parasites portées par les individus infectés (Pradines et al., 2010). Les facteurs qui favorisent l’émergence de la chimiorésistance sont :
• La mauvaise utilisation des antipaludiques par les individus infectés : automédication abusive, mauvaise observance, la prescription irrationnelle des antipaludiques, vente illicite des médicaments ;
• L’indisponibilité des médicaments efficaces ou le déploiement inadéquat des médicaments sous forme de monothérapie ;
• La consommation de contrefaçon ;
• L’absence ou non-respect des directives nationales ;
• La production rapide de gamétocytes porteurs du gène de résistance. (Bouchaud, 2008 ; Pradines et al., 2010)
Les mécanismes de chimiorésistance
Selon leur mécanisme d’action, les médicaments antipaludiques peuvent être classés en deux groupes : les lysosomotropes et les antimétaboliques. Ces mécanismes d’action sont à l’origine de deux mécanismes de résistance (Le Bras et al., 2006).
Mécanisme de résistance aux lysosomotropes
Les lysosomotropes sont des schizonticides, ayant pour cible la vacuole digestive du parasite. Ils comprennent toutes les molécules possédant un noyau quinoléine (Chloroquine, Amodiaquine, Pipéraquine), les aminoalcools (Quinine, Méfloquine et Halofantrine) et les dérivés de l’Artémisinine.
La Chloroquine
La Chloroquine est un antipaludique de synthèse mise sur le marché en 1934. Elle a joué un rôle prépondérant dans la thérapie et la chimioprophylaxie du paludisme grâce à ses propriétés exceptionnelles et la lenteur d’apparition de la chloroquinorésistance en 1957 (Thompson et Werbel, 1972 ; Wellems et Plowe, 2001 ; Talisuna et al., 2004).
Son activité est liée à ses propriétés d’accumulation sélective dans l’hématie parasitée et sa localisation préférentielle dans la vacuole digestive. A l’intérieur de cette vacuole, elle est protonée et ne peut plus traverser librement la membrane vacuolaire. La Chloroquine perturbe la formation de l’hémozoïne. En effet, elle inhibe la cristallisation de l’hème (substance toxique issue de la dégradation de l’hémoglobine érythrocytaire) en hémozoïne substance non toxique (Petersen et al., 2011).
Le principal mécanisme de résistance à la Chloroquine est l’efflux de médicament par PfCRT (Plasmodium falciparum Chloroquinorésistance) (Djimdé et al., 2001). PfCRT est une protéine de transport membranaire de la vacuole digestive codée par le gène Pfcrt localisé au niveau du chromosome 7. Cette protéine pourrait expulser activement la Chloroquine de la vacuole digestive. Elle est capable aussi d’altérer le pH ou la Chloroquine protonée pourrait être transportée passivement à l’extérieur de la vacuole. Ces phénomènes sont dus à des mutations au niveau du gène Pfcrt. La mutation K76T au niveau de ce gène est associée à la résistance de P. falciparum à la Chloroquine au point qu’elle soit présente dans toutes les souches résistantes (Johnson et al., 2004 ; Sanchez et al., 2004 ; Picot et al., 2009).
L’Amodiaquine
L’Amodiaquine a récemment connu un regain d’intérêt dans le traitement de l’accès palustre simple, en association avec les dérivés de l’Artémisinine et plus particulièrement l’Artésunate. Le mode d’action de l’Amodiaquine semble être le même que celui de la Chloroquine. Son accumulation est corrélée à celle de la Chloroquine et est aussi diminuée chez les isolats chloroquinorésistants (Bray et al., 1996).
Les mutations N86Y, Y184F et D1246Y, au niveau du gène Pfmdr1 ont été associées à une sensibilité réduite à l’Amodiaquine (Durrand et al., 2004). De plus, la combinaison des allèles mutants 76T et 86Y au niveau des gènes Pfcrt et Pfmdr1 respectivement a été associée à une réduction de la sensibilité de P. falciparum à l’Amodiaquine (Happi et al., 2006 ; Djimde et al., 2008).
La Luméfantrine
C’est un schizonticide sanguin contre les stades érythrocytaires de Plasmodium falciparum. La Luméfantrine est administrée en association avec l’Artéméther pour une efficacité améliorée. Avec une demi-vie plus longue que l’Artéméther, elle élimine les parasites résiduels.
Le mécanisme exact d’action de la Luméfantrine reste inconnu. Cependant, des études suggèrent qu’elle inhibe la formation de β-hématine en formant un complexe avec l’hémine. Elle inhibe aussi la synthèse d’acide nucléique et de protéine (DrugBank, 2018).
La chimiorésistance de P. falciparum à la Luméfantrine est liée à des modifications au niveau du gène Pfmdr1. Les mutations N86Y, Y184F, D1246Y et l’augmentation du nombre de copie du gène Pfmdr1 ont été associées à une sensibilité réduite de P. falciparum à la Luméfantrine (Sisowath et al., 2007 ; Pradines et al., 2010).
Les dérivés de l’Artémisinine
Découvert par le Professeur Youyou TU prix Nobel de médecine en 2015, l’Artémisinine et ses dérivés ont radicalement améliorés le traitement contre le paludisme. Dans les CTA, les dérivés de l’Artémisinine confèrent une efficacité rapide et puissante. Leur taux élevé de clairance plasmatique (demi-vie < à 1heure) est compensé par un deuxième antipaludique à demi-vie plasmatique plus longue (comme la Luméfantrine, la Méfloquine, l’Amodiaquine, la Pipéraquine ou la Sulfadoxine-Pyrimétamine) en tant que médicament associé (Haldar et al., 2018).
L’Artémisinine et ses dérivés empêchent la désintoxication des déchets de l’hémoglobine (hème) par le parasite. Ils sont responsables de l’alkylation des protéines et de l’hème entrainant des dommages oxydatifs. La résistance de P. falciparum aux dérivés de l’Artémisinine se traduit par une réduction importante de la vitesse d’élimination des parasites chez les patients traités (demi-vie de clairance parasitaire) par un dérivé d’artémisinine seul ou en association avec une molécule partenaire (CTA) (Robert et al., 2005 ; Flegg et al., 2011). Cette clairance parasitaire retardée est due au nombre accru de stade anneau (jeune trophozoite) qui entre dans un état de quiescence lors de l’exposition aux dérivés de l’Artémisinine. Ces trophozoites reprennent rapidement leur croissance une fois le médicament éliminé. Cette capacité est conférée par des mutations au niveau du gène Pfk13 (Dondorp et al., 2009 ; Witkowski et al., 2010).
Le gène Pfk13 est localisé au niveau du chromosome 13. Il ne code ni pour un transporteur ni pour une enzyme. Sa fonction exacte n’est pas encore connue, mais des analogies sont possibles avec la fonction de la protéine Keap1 humaine, en particulier dans la réponse au stress oxydatif. PfK13 et Keap1 partagent des homologies dans le domaine BTB/POZ du C-terminale et les 6 domaines du kelch (Ariey et al., 2014 ; Fairhurst, 2015 ; Haldar et al., 2018).
A ce jour plus de 200 mutations non synonymes ont été signalées dans le gène Pfk13 dont neuf (9) ont été associées à la résistance aux dérivés d’Artémisinine dans le sud-est de l’Asie. Il s’agit des mutations C580Y, R539T, Y493H, et I543T dans le GMS (Sous-Région du grand Mékong) oriental (Cambodge, Laos et Vietnam) ; F446L, N458Y, P574L et R561H dans le GMS occidental (Chine Myanmar et Thaïlande) et la mutation P553L, retrouvée dans les 2 zones. Des études ont établi que la mutation C580Y était la mutation majeure (représentant 80% des cas de résistance) responsable de la résistance clinique aux dérivés d’Artémisinine en Asie du sud-est (Ashley et al., 2014 ; OMS, 2017a ; Ménard et al., 2016).
Mécanisme de résistance aux antimétaboliques : Sulfadoxine-Pyriméthamine
La Sulfadoxine et la Pyriméthamine inhibent respectivement les enzymes P. falciparum dihydroptéroate synthase (PfDHPS) et dihydrofolate réductase (PfDHFR) qui fonctionnent dans la voie des folates. La résistance à ces antipaludiques est conférée par des mutations au niveau des gènes Pfdhps et Pfdhfr. Les mutations N51I, C59R, S108N du gène Pfdhfr et les mutations A437G, K540E du gène Pfdhps ont été associées à la résistance à la combinaison Sulfadoxine-Pyriméthamine (Gregson et Plowe, 2005 ; Shah et al., 2011).
Méthodes de surveillance de l’efficacité des antipaludiques
La surveillance de la résistance aux médicaments antipaludiques repose sur 3 approches différentes et complémentaires :
• Le test in vivo visant à évaluer l’efficacité des médicaments chez les patients ;
• Les tests in vitro/ex vivo pour évaluer la sensibilité des parasites aux médicaments ;
• Les tests moléculaires pour détecter des mutations génétiques validées ou des modifications du nombre de copies de gènes associées à la résistance aux antipaludiques (Nsanzabana et al., 2018).
Les Tests in vivo
L’évaluation in vivo des médicaments est le » gold standard » de l’OMS pour le suivi de l’efficacité des antipaludiques. Les tests in vivo fournissent des informations sur l’efficacité du médicament étudié chez les patients. Néanmoins, elles sont difficiles à réaliser en raison de la lourdeur de la logistique et du coût.
La technique consiste à prescrire la dose requise de médicament antipaludique aux patients infestés par des parasites. Après avoir reçu un traitement approprié, les patients sont suivis par des évaluations parasitologiques et cliniques pendant un nombre de jours spécifiés (de 28 à 63 jours en fonction de la demi-vie du médicament évalué). Dans le protocole actuel de l’étude d’efficacité thérapeutique, le génotypage systématique est recommandé en cas d’échec clinique ou parasitologique. Ceci permet de distinguer la recrudescence des réinfections. Pour cela, trois gènes hautement polymorphes du parasites sont utilisés : les protéines de surface mérozoïte 1 et 2 (msp1, msp2) et les protéines riches en glutamate (glurp) (OMS, 2009).
Test in vitro / ex vivo
L’évaluation de la sensibilité de P. falciparum aux médicaments antipaludiques peut être effectuée de manière phénotypique, en utilisant des souches de parasites collectées chez des patients (ex vivo) ou avec des isolats adaptés à la culture (in vitro). Les méthodes in vitro / ex vivo fournissent des informations utiles sur la sensibilité du parasite. Toutefois, elles nécessitent un équipement de laboratoire lourd et un personnel hautement qualifié. L’évaluation peut être réalisée en cultivant des parasites en présence de médicaments antipaludiques à des concentrations variables pour déterminer l’effet inhibiteur de croissance des médicaments ou en exposant les parasites à une concentration élevée d’un antipaludique spécifique pendant une période relativement courte (Witkowski et al., 2013 ; Nsanzabana et al., 2018).
La croissance du parasite est ensuite mesurée à l’aide de diverses techniques et les résultats permettent de déterminer la concentration inhibant la croissance parasitaire de 50% (concentration inhibitrice 50%; CI50) ou le taux de survie (Witkowski et al., 2013 ; Woodrow et al., 2013).
Etude des marqueurs moléculaires de résistance
Les marqueurs moléculaires validés sont très pertinents pour détecter et surveiller en temps réel la résistance. Leur prévalence dans une population parasitaire est souvent un bon indicateur du niveau de résistance clinique. Cette technique permet d’éliminer les facteurs humains. Elle est très sûre pour détecter les vraies résistances, plusieurs molécules aussi peuvent être testées avec seulement une tâche de sang sur un papier filtre. De plus, les échantillons sont facilement conservés et transportés. Cependant l’analyse des marqueurs moléculaires, nécessite un équipement spécifique et un personnel hautement qualifié.
Diverses méthodes ont été développées pour évaluer ces marqueurs de résistance connus. Le principe de base de la plupart des méthodologies d’évaluation des marqueurs génomiques associés à la pharmacorésistance est basé, sur l’amplification du gène ou des loci d’intérêt (Nsanzabana et al., 2018).
Les marqueurs moléculaires associés à la résistance de P falciparum aux différentes molécules antipaludiques sont (Tableau I) :
• le Plasmodium falciparum multidrug résistance 1 (pfmdr1) situé sur le chromosome 5 ;
• le Plasmodium falciparum chloroquinorésistance (pfcrt) situé sur le chromosome 7 ;
• le Plasmodium falciparum dihydrofolate réductase (pfdhfr) situé sur le chromosome 4 ;
• le Plasmodium falciparum dihydrofolate synthéase (pfdhps) situé sur le chromosome 8 (Pradines et al., 2010) ;
• Le Plasmodium falciparum Cytochrome b (PfCyt b) ;
• Le Plasmodium falciparum kelch propeller (PfK13) situé sur le chromosome 13 (Ariey et al., 2014);
• Le Plasmodium falciparum plasmepsine 2 copy number (Witkowski et al., 2017). (voir Tableau I)
Tableau I : Antipaludiques et marqueurs moléculaires de résistance associés. (Haldar et al., 2018)
Figure 4 : Introduction et apparition de la résistance aux différentes molécules antipaludiques (Pradines et al., 2010)
MATERIELS ET METHODES
Cadre de l’étude
La région de Kédougou est située au sud-est du Sénégal, à environ 700km de Dakar. Elle est un véritable carrefour frontalier du Mali, à l’est et de la Guinée, au sud (Figure 5). Sa population est estimée 172 482 habitants sur une superficie de 16 896km².
Figure 5 : Carte administrative de la région de Kédougou (ANSD, 2014)
Cette région est caractérisée par un climat de type soudano-sahélien avec deux saisons : saison sèche de Décembre à Mai et une saison des pluies de Juin à Novembre. La saison de transmission du paludisme est donc longue avec un taux d’inoculation entomologique d’environ 100 piqûres infectantes par homme et par an. Le paludisme y est endémique avec une recrudescence saisonnière. Selon le bulletin épidémiologique annuel du PNLP 2017, la région de Kédougou a enregistré environ 18,71% (74049/395706) des cas de paludisme au Sénégal, 9,73% (1018/10463 cas) ont développé un paludisme grave. Cette région a enregistré aussi 14,43% (41/284) des cas de décès liés au paludisme en 2017 (ANSD, 2014 ; PNLP, 2018). En raison de ce niveau d’endémicité, Kédougou est une des régions éligible, sélectionnée depuis 2013 par le PNLP pour l’application de la chimio prévention (CPS) du paludisme saisonnière chez les enfants de moins de 5ans.
La richesse de cette zone en ressources naturelles, telle qu’aurifère a encouragé la forte implantation de diverses communautés qui pratiquent cette activité de façon artisanale. Plus de 10 nationalités sont représentées dans cette région, avec une forte représentation des Maliens, Burkinabés, et des Guinéens. Cette affluence relative générée par l’orpaillage favorise la vente informelle de médicaments qui est un des facteurs clé de l’émergence de la chimiorésistance. En effet, elle favorise l’automédication abusive et la consommation de médicaments contrefaits. (ANSD, 2018)
Population d’étude
Dans le cadre de notre étude, nous avons travaillé sur 150 échantillons collectés entre 2015 et 2017 dont 50 chaque année. Ces derniers sont obtenus à partir de patients atteints de paludisme simple, venus en consultation dans le centre de santé de Dalaba.
Critères d’inclusion
Les patients inclus dans notre étude ont été sélectionnés selon les critères suivants :
• Une monoinfection à P. falciparum, confirmée par TDR et microscopie
• Age supérieur ou égal à 6 mois
• Poids supérieur ou égal à 9 kg
• Taux d’hémoglobine supérieur ou égal à 5 g/dL
• Glucose sanguin supérieur ou égal à 40 mg/dl
• Consentement libre et éclairé
Critères de non inclusion
• Co-infection avec d’autres espèces plasmodiales
• Signes de paludisme grave ou cérébral, d’abattement physique/psychologique
• Hypersensibilité à l’Artéméther ou à la Luméfantrine
• Vomissement et/ou incapable de prendre des médicaments par voie orale
• Co-morbidité aiguë (pneumonie, la malnutrition sévère)
• Vivre à plus de 10 km du centre de santé
Considération éthique
Le protocole de recherche avait été soumis au Comité d’Éthique National de Recherche en Santé du Sénégal et une autorisation administrative avait été aussi demandée au Ministère de la Santé et l’Action Sociale. Une lettre d’acceptation de l’étude avait aussi été adressée au Médecin Chef de District de Kédougou qui avait donné un avis favorable pour le déroulement de l’étude.
Méthodologie
Un prélèvement de sang veineux (5 mL sur tube EDTA) a été effectué sur chaque patient éligible. Quatre (4) spots de sang ont été réalisés sur un papier filtre (Whattmann® 3MM CHR CAT N° 3030-662) pour chaque prélèvement (Figure 6). Ces papiers filtres ont été utilisés pour l’extraction de l’ADN du parasite.
Figure 6 : Spots de sang parasité sur papier filtre
Au cours de l’étude, les marqueurs de résistance suivant : Plasmodium falciparum chloroquinorésistance (K76T Pfcrt), Plasmodium falciparum multidrug résistant 1 (N86Y, Y184F, D1246Y Pfmdr1) et le Kelch (C580Y Pfk13) ont été génotypé. Pour cela la High Résolution Meelting (HRM) a été utilisée.
Extraction de l’ADN
L’ADN est obtenu à partir des spots de sang des papiers filtres. L’extraction est faite conformément au protocole d’extraction d’ADN à partir de papier filtre du QIA amp DNA Mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) (figure 7).
Figure 7 : kit d’extraction d’ADN QIA amp DNA Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA).
La high résolution melting (HRM)
Principe
La « High Résolution Melting » (HRM) ou courbe de fusion à haute résolution est une technique d’analyse post-PCR. Elle est utilisée pour identifier des variations au niveau de l’ADN.
La HRM se déroule en deux (2) étapes, une amplification (PCR) suivie d’une fusion de l’ADN amplifiée. Elle repose sur l’intégration dans l’ADN amplifié d’un fluorochrome intercalant. L’augmentation de la température programmée et progressive entraîne ainsi une dénaturation. Cette dénaturation provoque l’élimination du fluorochrome et induit donc une baisse de la fluorescence ; son extinction est totale lorsque la dénaturation est complète. Chaque séquence d’ADN aura donc, une température standard, une signature lumineuse spécifique représentée par une courbe de fusion. Un changement de la séquence d’ADN (mutation, délétion…) induit une modification de la cinétique de fusion de l’ADN, détectée par l’existence d’un autre profil. Pour une mutation inconnue, la HRM ne permettant pas d’identifier précisément la nature de cette dernière, une confirmation des résultats mutés par séquençage est nécessaire.
Mode opératoire
Le light cycle 96 a été utilisé pour faire la réaction (figure 8). C’est un instrument destiné à réaliser une PCR rapide et précise, associé à la détection en ligne et en temps réel de colorant fluorescent se liant à l’ADN ou de sondes marquées, permettant la quantification ou la caractérisation d’un acide nucléique cible.
Nous avons utilisé des sondes spécifiques à chaque codon étudié et des amorces sens et anti-sens spécifiques à chaque marqueur (Tableau II). La PCR est asymétrique, elle consiste à utiliser 5 fois plus d’amorces anti-sens que d’amorces sens. L’excès de simples brins d’ADN qui en résulte sert de substrat pour la sonde.
Pour lancer une réaction HRM il faut au préalable disposé de l’ADN ensuite préparer les mélanges réactionnels.
Tableau II : Séquence des amorces et sondes (Daniels et al., 2012)
Le mélange réactionnel
Le mélange réactionnel est constitué de lightscanner mix et d’un mélange amorces-sonde. Ce dernier comprend : les amorces sens et anti-sens, la sonde spécifique au codon étudié et de l’eau (grade water) (Tableau III). Ce mélange réactionnel est obtenu selon la proportion suivante : 1ul du mélange amorces-sonde dans 4 μl de lightscanner mix
Le light cycle 96 est une machine très sensible qui ne nécessite pas beaucoup d’ADN. Par conséquent, l’ADN est au préalable dilué : 5 μl d’ADN dans 75 μl d’H2O (nulécase free water). Chaque échantillon doit contenir 2,5 μl d’ADN dilué et 2,5 μl de master mix pour la réaction HRM. Les échantillons sont distribués sur une plaque de 96 puits. Le mélange est d’abord mixé au vortex puis centrifugé avant d’introduire la plaque dans la machine qui se charge de faire la réaction. Des contrôles sauvages et mutants sont utilisés lors de la manipulation pour l’interprétation des résultats (Tableau IV).
Table des matières
Introduction
CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. 1. Généralités sur le paludisme
I. 1. 1. Agents pathogènes
I. 1. 1. 1 Classification
I. 1. 1. 2 Cycle biologique du parasite
I. 1. 1. 2. 1 Chez l’homme
I. 1. 1. 2. 1. 1. Stade pré-érythrocytaire
I. 1. 1. 2. 1. 2. Stade érythrocytaire
I. 1. 1. 2. 2. Chez le moustique
I. 1. 2. Le vecteur
I. 1. 3. Les modes de transmission du paludisme
I. 1. 4. Les signes cliniques de la maladie
I. 1. 4. 1. Paludisme non compliqué
I. 1. 4. 2. Paludisme grave
I. 1. 5 Le diagnostic du paludisme
I. 1. 6. Le traitement du paludisme
I. 1. 7. La prophylaxie du paludisme
I. 1. 7. 1. La lutte antivectorielle
I. 1. 7. 2. La chimioprévention
I. 1. 7. 3. Le vaccin
I. 2. Résistance de P. falciparum aux antipaludiques
I. 2. 1. Définition
I. 2. 2. Les facteurs favorisant la survenue de la chimiorésistance
I. 2. 3. Les mécanismes de chimiorésistance
I. 2. 3. 1. Mécanisme de résistance aux lysosomotropes
I. 2. 3. 1. 1. La Chloroquine
I. 2. 3. 1. 2. L’Amodiaquine
I. 2. 3. 1. 3. La Luméfantrine
I. 2. 3. 1. 4. Les dérivés de l’Artémisinine
I. 2. 3. 2. Mécanisme de résistance aux antimétaboliques : Sulfadoxine-Pyriméthamine
I. 2. 4. Méthodes de surveillance de l’efficacité des antipaludiques
I. 2. 4. 1 Les Tests in vivo
I. 2. 4. 2. Test in vitro / ex vivo
I. 2. 4. 3. Etude des marqueurs moléculaires de résistance
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES
II. 1. Cadre de l’étude
II. 2. Population d’étude
II. 2. 1. Critères d’inclusion
II. 2. 2. Critères de non inclusion
II. 3. Considération éthique
II. 4. Méthodologie
II. 4. 1. Extraction de l’ADN
II. 4. 2. La high résolution melting (HRM)
II. 4. 2. 1. Principe
II. 4. 2. 2. Mode opératoire
II. 4. 2. 2. 1. Le mélange réactionnel
II. 4. 2. 2. 2. Analyse et interprétation des résultats
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
III. 1. Résultats
III. 1. 1. Caractéristiques de la population d’étude
III. 1. 2. Prévalence de la mutation C580Y de Pfk13
III. 1. 3. Prévalence de la mutation K76T du gène Pfcrt
III. 1. 4. Prévalence des mutations au niveau des codons 86, 184 et 1246 du gène Pfmdr1
III. 1. 4. 1. Au niveau du codon 86
III. 1. 4. 2. Au niveau du codon 184
III. 1. 4. 3. Au niveau du codon 1246
III. 2. Discussion
Conclusion et perspectives
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
WEBOGRAPHIE
